歐陽(yáng)波 陳勇軍 唐小容 張衡生 紀(jì)雄英

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 1中醫(yī)康復(fù)科，湖南 衡陽(yáng) 421002；2腔鏡室；3神經(jīng)內(nèi)科)

缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，腦組織內(nèi)氧化反應(yīng)異常，機(jī)體內(nèi)自由基得到積累，引起細(xì)胞內(nèi)能量代謝障礙、DNA斷裂等，最終促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔1～4〕。神經(jīng)細(xì)胞凋亡在腦缺血再灌注損傷機(jī)制的研究中發(fā)揮重要作用。探究中斷腦缺血誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)的潛在靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。硫氧還蛋白(Trx)1，具有強(qiáng)大的抗氧化和抗凋亡作用〔5〕，但目前關(guān)于Trx1調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)探討Trx1對(duì)氧糖剝奪的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠(出生48 h內(nèi))購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雌雄不限，體重10～13 g。

1.2主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京康為試劑生物科技有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，Trx1抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗體、活化的(Cleaved)Caspase-3抗體、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司。

1.3細(xì)胞的培養(yǎng) 根據(jù)參考文獻(xiàn)〔6〕，收集并鑒定大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔2 d更換一次培養(yǎng)基，其細(xì)胞濃度達(dá)到70%～80%，加入胰酶消化，以1∶2或1∶3的比例進(jìn)行傳代。

1.4缺血再灌注損傷模型的構(gòu)建 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的星形膠質(zhì)細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換為不含血清的培養(yǎng)基，5%CO2、95%N2環(huán)境中培養(yǎng)6 h，棄去培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，5%CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)氧24 h，以正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為4組，對(duì)照組、氧糖剝奪(OGD)模型組、小干擾(si)RNA-NC組、siRNA-Trx1組。轉(zhuǎn)染前24 h，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的星形膠質(zhì)細(xì)胞，調(diào)整為5×105個(gè)，待細(xì)胞濃度達(dá)到80%～90%開始轉(zhuǎn)染。將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM，稀釋A液：將siRNA和Lipofectamine 2000分別與Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻，室溫孵育10 min；然后將兩稀釋液充分混合，室溫靜置5 min，每孔細(xì)胞中加入上述復(fù)合物，37℃培養(yǎng)4～6 h，更換為完全培養(yǎng)基。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 收集5×105個(gè)細(xì)胞，加入1 ml Trizol提取細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物有限公司合成，Trx1引物上游序列為5′-CCTTCTTTCATTCCCTCTGTGA-3′，下游序列為5′-CCCAACCTTTTGACCCTT TTTA-3′。反應(yīng)條件為95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖 將各組星形膠質(zhì)細(xì)胞密度調(diào)整5×103個(gè)，接種與96孔板上，培養(yǎng)48 h，每孔加入50 μl MTT，37℃孵育4 h后，每孔加入150 μl DMSO，搖床中振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞490 nm波長(zhǎng)的吸光值。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明書所示，收集各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，加入100 μl細(xì)胞緩沖液，加入Annexin V-FITC和PI，避光，4℃染色15 min，然后加入400 μl細(xì)胞緩沖液，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的凋亡率。

1.9免疫印跡實(shí)驗(yàn) 棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS清洗3次，加入適量細(xì)胞蛋白裂解液，冰浴15 min，收集上清即為細(xì)胞總蛋白。BCA試劑盒法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取200 μl蛋白樣品，沸水加熱5 min，使蛋白充分變性；加入電泳液，吸取40 μg總蛋白加入上樣孔，上層膠電壓為80 V，電泳30 min，下層膠電壓為100 V，電泳100 min。根據(jù)目的蛋白分子量大小，切凝膠帶，依次放入濾紙、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、凝膠、濾紙，恒定電壓105 V轉(zhuǎn)膜105 min；將PVDF膜置于封閉液中，輕輕搖動(dòng)1 h；加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次×10 min，加入二抗，37℃孵育1 h，TBST漂洗3次×10 min，避光，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液，凝膠成像儀中拍照，Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)灰度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞中Trx1基因的表達(dá)量比較 OGD模型組、siRNA-NC組、siRNA-Trx1組Trx1 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)；與OGD模型組相比，siRNA-NC組Trx1的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，siRNA-Trx1組星形膠質(zhì)細(xì)胞中Trx1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2下調(diào)Trx1基因的表達(dá)量對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，OGD模型組、siRNA-NC組、siRNA-Trx1組星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖顯著下降(P<0.05)；與OGD模型組相比，siRNA-NC組星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，siRNA-Trx1組星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3下調(diào)Trx1基因的表達(dá)量對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，OGD模型組、siRNA-NC組、siRNA-Trx1組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與OGD模型組相比，siRNA-NC組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著變化(P>0.05)，siRNA-Trx1組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組Trx1基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白水平比較

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與OGD模型組相比：2)P<0.05

2.4下調(diào)Trx1基因的表達(dá)量對(duì)星形膠質(zhì)凋亡相關(guān)蛋白水平的影響 各組Caspase-3蛋白的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組相比，OGD模型組、siRNA-NC組、siRNA-Trx1組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白、Bax蛋白的表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與OGD模型組相比，siRNA-NC組星形膠質(zhì)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白無(wú)顯著變化(P>0.05)，siRNA-Trx1組星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白、Bax蛋白的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

1～4：對(duì)照組、OGD模型組、siRNA-NC組、siRNA-Trx1組圖1 Western印跡檢測(cè)各組Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞的重要成員之一，有助于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的完整性。研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞具有多種生理功能，比如調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的新陳代謝、處理細(xì)胞外的有毒物質(zhì)、對(duì)血管結(jié)構(gòu)完整性的維持、調(diào)控神經(jīng)突觸的生成和遞質(zhì)的釋放〔7～10〕。腦缺血再灌注損傷過(guò)程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞功能紊亂進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)元的損傷，因此，探究腦缺血再灌注損傷過(guò)程中減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡具有重要的作用。研究表明，氧糖剝奪損傷促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡〔11〕。研究表明，Trx1具有抗凋亡和氧化、降低炎癥反應(yīng)、保護(hù)腦缺血再灌注損傷和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等作用。在Trx1表達(dá)量上調(diào)的轉(zhuǎn)基因小鼠中，通過(guò)構(gòu)建大腦中動(dòng)脈缺血模型發(fā)現(xiàn)，模型小鼠的受損區(qū)顯著小于對(duì)照組，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率明顯降低〔12〕。在腦缺血過(guò)程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的程度顯著小于神經(jīng)元，其中Trx1的基礎(chǔ)活性及誘導(dǎo)水平均顯著增加〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Trx1可抑制氧糖剝奪損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其增殖，從而對(duì)腦缺血損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

在細(xì)胞的凋亡過(guò)程中，Bcl-2、Bax與凋亡發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Bcl-2、Bax表達(dá)量的變化決定細(xì)胞凋亡程序是否啟動(dòng)，其中Bcl-2在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮抗凋亡的作用，其表達(dá)量的增加會(huì)抑制細(xì)胞的凋亡率；Bax在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮促凋亡作用，其表達(dá)量的增加會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔14～16〕。研究表明Bcl-2、Bax參與過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程〔17〕。體外共培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，其中間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素6阻礙氧糖剝奪的星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制與促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)量和降低Bax的表達(dá)量密切相關(guān)〔18〕。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要的蛋白酶之一，是多種細(xì)胞介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路的共同下游靶蛋白，使細(xì)胞凋亡過(guò)程中蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的樞紐〔19，20〕。本研究經(jīng)過(guò)構(gòu)建氧糖剝奪損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白水平明顯降低，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平顯著增加，而抑制Trx1表達(dá)量后，星形膠質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2蛋白水平進(jìn)一步降低，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平進(jìn)一步增加，表明氧糖剝奪損傷后抑制Trx1表達(dá)，可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax/Cleaved Caspase-3信號(hào)通路蛋白的表達(dá)量促進(jìn)細(xì)胞的凋亡、抑制細(xì)胞增殖。

綜上，抑制氧糖剝奪損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Trx1表達(dá)量，顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控Bcl-2/Bax/Cleaved Caspase-3信號(hào)通路蛋白表達(dá)量發(fā)揮作用。