肖永珊 焦玲 翟素珍 邰勝燕 楊慧 張春林

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550001；2附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；3科研中心；4 2016級研究生；5 2018級研究生)

研究表明帕金森病(PD)患者腦黑質(zhì)(SN)中鐵異常沉積與PD有密切聯(lián)系〔1～10〕。鐵蛋白由鐵蛋白重鏈(FTH)和鐵蛋白輕鏈(FTL)組成〔11〕。鐵蛋白的功能障礙會(huì)引起游離鐵(Fe2+)的存在，進(jìn)而導(dǎo)致鐵沉積。當(dāng)鐵過量存在時(shí)，F(xiàn)e2+通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生活性氧(ROS)〔12～14〕，使細(xì)胞置于有害的氧化應(yīng)激下。鐵蛋白主要受鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)與鐵響應(yīng)元件(IRE)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。通常，IRPs與FTH、FTL mRNA的5′UTR中的IRE結(jié)合導(dǎo)致mRNA翻譯阻斷和蛋白質(zhì)表達(dá)下降〔12,15〕。研究證實(shí)PD患者或PD模型的IRPs/IRE 通路可被細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、一氧化氮(NO)等激活〔16,17〕。α-硫辛酸(LA)可降低PD模型鼠氧化應(yīng)激，減輕多巴胺能神經(jīng)元的損傷〔18～22〕。本實(shí)驗(yàn)主要探討α-LA對PD細(xì)胞模型FTH和FTL的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與藥物 胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)和高糖DMEM(Hyclone公司)；6-羥基多巴胺(OHDA)與α-LA(美國Sigma公司)；丙二醛(MDA)和細(xì)胞鐵測試盒(南京建成生物工程研究所)；一抗和二抗分別購自北京博奧森、博士德生物技術(shù)有限公司。

1.1.2細(xì)胞株 PC12 細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；HHYZr電熱恒溫水浴箱(北京市光明醫(yī)療器械廠)；Nikon倒置顯微鏡(日本)；超微量紫外分光光度儀Nanodrop2000(美國Thermo公司)；Beckman21R型冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)； BIO-RAD Power-pac 3000電泳儀(美國BIO-RAD公司)；Trans-Blot Turbo 全能型蛋白快速轉(zhuǎn)膜儀(美國BIO-RAD公司)；ChemiDoc MP 全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)等。

1.2方法

1.2.1PC12細(xì)胞培養(yǎng) 配置10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將復(fù)蘇凍存的 PC12接種于配置好的培養(yǎng)基中5% CO2,37℃培養(yǎng)，1～2 d換液，胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2篩選最適造模濃度 以0.45×105個(gè)/ml細(xì)胞接種于96孔板 5% CO2,37℃培養(yǎng)。次日棄培養(yǎng)基，加入6-OHDA(0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入180 μl無血清培養(yǎng)基及20 μl 5 mg/ml噻唑藍(lán)(MTT)，再次培養(yǎng)4小時(shí)后棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，搖床上震蕩10 min，直至藍(lán)紫色結(jié)晶產(chǎn)物完全溶解。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，在酶標(biāo)儀上讀取490 nm處各孔吸光度值(OD值)，用OD值計(jì)算細(xì)胞存活率，篩選最適造模濃度〔23〕。

1.2.3MTT法選擇α-LA治療濃度 以0.45×105個(gè)/ml細(xì)胞接種于96孔板 5% CO2，37℃培養(yǎng)。24 h后，棄培養(yǎng)基，加入α-LA(0.0、0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μmol/L)預(yù)處理，培養(yǎng)1 h后加 6-OHDA(100 μmol/L)。以未加α-LA及6-OHDA為對照組。次日使用MTT法選擇最適的α-LA治療濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為3組：對照組(無血清培養(yǎng)基)、模型組(6-OHDA 100 μmol/L)、α-LA組(100 μmol/L α-LA預(yù)處理1 h后再加入100 μmol/L 6-OHDA)。3組細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.5檢測細(xì)胞內(nèi)鐵含量和MDA 對照組、模型組及α-LA組細(xì)胞培養(yǎng)后用裂解液裂解，獲取上清后首先用于蛋白定量，剩余的根據(jù)試劑盒操作說明用于測定細(xì)胞內(nèi)鐵含量及MDA水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Western印跡檢測IRP1、IRP2及FTH和FTL蛋白表達(dá)量 提取對照組、模型組及α-LA組的蛋白樣本，經(jīng)過二喹啉甲酸(BCA)定量后計(jì)算上樣量。接著上樣后十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰凝胺膠電泳(PAGE)(80 V 30 min，120 V 90 min)，然后用Trans-Blot Turbo 伯樂全能型蛋白快速轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(不同抗體轉(zhuǎn)膜時(shí)間不同)，用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉，1 h后加入抗鼠多克隆抗體IRP1(1∶300)、IRP2抗體(1∶300)、FTH抗體(1∶500)和FTL抗體(1∶100)，4℃過夜。次日，TBST漂洗3次，每次10 min，加1∶10 000的二抗室溫孵育，1 h后再用TBST(10 min×3次)清洗，最后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，利用Bio-Rad ChemiDoc MP 全能型凝膠成像分析系統(tǒng)顯影分析。用Image J分析灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.16-OHDA對PC12細(xì)胞存活率的影響 與0.0 μmol/L濃度(100%)比，12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L濃度6-OHDA細(xì)胞存活率分別為：(92.64±4.40)%、(83.29±5.68)%、(75.39±4.92)%、(66.50±4.98)%、(30.51±2.23)%，隨著6-OHDA濃度持續(xù)增加細(xì)胞存活率則持續(xù)顯著降低(P<0.05,P<0.01)。6-OHDA在100 μmol/L 時(shí)對細(xì)胞存活有明顯抑制,而在200 μmol/L時(shí)大多數(shù)細(xì)胞死亡，不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故最終選100 μmol/L作為最適造模濃度。

2.2α-LA治療濃度選擇 對照組及α-LA 0.0、0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μmol/L濃度組細(xì)胞存活率分別為：100%、(66.50±4.55)%、(72.27±5.61)%、(77.26±6.70)%、(81.75±3.13)%、(85.34±4.24)%、(72.46±4.70)%。α-LA 0 μmol/L組較對照組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)，說明造模成功。與0.0 μmol/L比較，α-LA 0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0 μmol/L 濃度組細(xì)胞存活率均升高，但只有10、100 μmol/L濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取100 μmol/L 作為α-LA組保護(hù)藥濃度。

2.3各組MDA及鐵含量比較 與對照組相比，模型組MDA及鐵含量明顯增加(P<0.01)；α-LA組MDA及鐵含量顯著低于模型組(P<0.01)。見表1。

2.4各組IRP1、IRP2及FTH、FTL蛋白表達(dá)比較 與對照組相比，模型組IRP1 和 IRP2 表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)，F(xiàn)TH與FTL表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；α-LA組與模型組相比，IRP1 和IRP2 蛋白表達(dá)量均顯著下降(P<0.01)，F(xiàn)TH與FTL蛋白表達(dá)量均顯著上升(P<0.01)。見表1、圖1、圖2。

表1 各組MDA、鐵含量及IRP1、IRP2、FTH、FTL蛋白相對表達(dá)水平比較

與對照組比較：1)P<0.01,與模型組相比：2)P<0.01

圖1 Western印跡檢測IRP1、IRP2蛋白表達(dá)

圖2 Western印跡檢測FTH、FTL蛋白表達(dá)

3 討 論

α-LA具有以下特點(diǎn)：(1)容易吸收，無論是腹腔注射還是口服給藥，吸收率均為80%。(2)在細(xì)胞內(nèi)容易轉(zhuǎn)化。(3)在水相和脂質(zhì)中的溶解性好。(4)能捕捉各種氧自由基并與金屬絡(luò)合。(5)目前應(yīng)用于其他疾病中毒副作用小〔24〕。鑒于腦內(nèi)鐵沉積與PD發(fā)病相關(guān)，通過維持鐵代謝穩(wěn)態(tài)平衡，減少細(xì)胞內(nèi)游離鐵沉積是治療PD的方法之一〔25,26〕。

由于人腦中大多數(shù)鐵作為鐵蛋白結(jié)合鐵存在，因此鐵蛋白的結(jié)構(gòu)或功能的任何變化都至關(guān)重要。FTH含有亞鐵氧化酶活性，F(xiàn)TL 主要攜帶鐵離子〔11〕。在有O2存在的情況下，F(xiàn)TH將Fe2+氧化為Fe3+，F(xiàn)e3+與FTL結(jié)合形成鐵結(jié)合蛋白，并以這種方式將鐵儲存起來。鐵穩(wěn)態(tài)的嚴(yán)格調(diào)控不僅對維持正常的細(xì)胞功能至關(guān)重要，而且對于防止鐵介導(dǎo)的氧化應(yīng)激至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA作用于多巴胺能細(xì)胞時(shí)可被多巴胺能神經(jīng)元選擇性攝入，通過上調(diào)蛋白激酶(PK)C的表達(dá)來誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)〔27〕，結(jié)果提示6-OHDA誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激及鐵沉積，對細(xì)胞造成了損傷；而氧化應(yīng)激激活了IRP/IRE通路，上調(diào)了IRPs的表達(dá)，促使IRP蛋白與FTH、FTL mRNA的5′UTR結(jié)合,導(dǎo)致翻譯抑制和靶蛋白的下調(diào)，進(jìn)而使游離鐵不能以鐵蛋白的形式儲存下來，自由鐵增多，導(dǎo)致腦內(nèi)鐵沉積，與相關(guān)研究結(jié)果一致〔28～31〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示α-LA抑制了氧化應(yīng)激水平并減少了細(xì)胞內(nèi)鐵沉積，對PD模型細(xì)胞起到良好的保護(hù)作用；α-LA通過抗氧化應(yīng)激作用抑制IRP/IRE通路，上調(diào)FTH和FTL的表達(dá)，增加細(xì)胞對鐵的儲存，減少鐵沉積。另一種猜想是，α-LA螯合了多余的游離鐵離子，抑制了 Fenton 反應(yīng)，阻斷具有高度細(xì)胞毒性 OH·的生成，抑制鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)FTH和FTL的表達(dá)，恢復(fù)了鐵蛋白的活性，進(jìn)而使游離鐵以鐵蛋白的形式儲存下來，從而改善了細(xì)胞的損傷。綜上，α-LA降低了PD細(xì)胞模型中的鐵含量和氧化應(yīng)激水平，對PD細(xì)胞模型具有保護(hù)作用。α-LA下調(diào)了PD細(xì)胞模型中IRPs的表達(dá)，并上調(diào)了FTH及FTL的表達(dá)，增加了細(xì)胞對鐵的儲存，改善PD中的鐵沉積，為臨床治療提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。