梁述章，宋 煒，馬春艷，蔣科技，

張鳳英1，趙 明1，馬凌波1

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部遠洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

棘頭梅童魚（Collichthys lucidus），屬鱸形目（Perciformes），石首魚科（Sciaenidae），梅童魚屬，為短距離洄游的淺海魚類，喜棲息在河口咸淡水交匯處，生長速度快，適溫、適鹽范圍廣［1-4］。其肉質(zhì)細嫩可口，沿海居民喜食此魚，而目前市場銷售的棘頭梅童魚數(shù)量有限，價格居高，無法滿足市場需求［5］。近幾年中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所研究團隊加大了棘頭梅童魚人工繁育和馴養(yǎng)技術(shù)的攻關(guān)力度，取得了可喜的成果。而對棘頭梅童魚遺傳結(jié)構(gòu)的認識，也是該物種保護和合理利用的重要內(nèi)容。

魚類線粒體DNA（mt DNA）與其它許多脊椎動物的mt DNA一樣，結(jié)構(gòu)簡單，母系遺傳，幾乎不發(fā)生重組，進化速度快，是魚類分子群體遺傳學和分子系統(tǒng)學理想的分子標記［6-8］?？刂茀^(qū)（D-loop區(qū)）是mt DNA上的一段非編碼區(qū)，在mt DNA上，D-loop區(qū)的進化速度最快，較適合用于種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析［9-10］。目前，僅見鄭德峰等［11］和殷麗娜［12］利用線粒體控制區(qū)對棘頭梅童魚的遺傳特征和遺傳分化進行了初步分析，為更好地認識我國沿海棘頭梅童魚群體遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，本研究利用線粒體D-loop區(qū)對棘頭梅童魚7個不同地理群體的遺傳多樣性進行評價，以期為棘頭梅童魚資源的保護和利用提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚分別采集于江蘇連云港、江蘇大豐、上海崇明、浙江舟山、浙江溫州、福建寧德和福建廈門海域（圖1）。樣品采集地點、時間、數(shù)量和體長等信息見表1。

1.2 DNA提取、擴增及測序

圖1 樣本采集地點Fig.1 Map of the sampling locations注：LYG：Lianyungang；DF：Dafeng；CM：Chongming；ZS：Zhoushan；WZ：Wenzhou；ND：Ningde；XM：XiamenNote：LYG：Lianyungang；DF：Dafeng；CM：Chongming；ZS：Zhoushan；WZ：Wenzhou；ND：Ningde；XM：Xiamen

樣本冰凍保存運輸至實驗室進行肌肉組織取樣，用于DNA提取。采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（北京，天根生化科技），以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，分光光度計檢測其濃度和純度。線粒體D-loop區(qū)域的引物序列為 AAATCCTTGAATAACACCGC（DL-F）和 ATCACTGCTGAGTTCCCTTG（DL-R），由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應體系為25μL：模板 DNA 1μL、酵母 PCR Mix 12.5μL、上下游引物各1μL，加雙蒸水至總體積25μL。PCR反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性25 s，58℃退火50 s，72℃延伸90 s，共40個循環(huán)；72℃最后延伸10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海杰李生物技術(shù)有限公司正反雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

序列經(jīng)拼接后，于 NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源檢測，利用Clustal X軟件對序列進行比對排序與校正；MEGA 5.1軟件用以統(tǒng)計群體的突變位點數(shù)、突變類型及核苷酸組成，計算群體內(nèi)和群體間的遺傳距離［13］；用 DnaSP 5.1軟件確定序列的單倍型數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性以及平均核苷酸差異數(shù)等參數(shù)［14］；基于Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建群體間單倍型的NJ樹，可靠性經(jīng) 1000次重復抽樣檢驗［15-16］；應用Arlequin 3.1軟件的分子方差分析（AMOVA）進行群體間的遺傳變異評估，通過1000次重抽樣來檢查不同遺傳結(jié)構(gòu)水平上協(xié)方差的顯著性［17］。采用分化固定指數(shù)Fst來評價兩兩群體間的遺傳差異，通過1000次重抽樣來檢查兩兩群體間的Fst顯著性，通過 Fst值計算基因流 Nm［18］。采用Network軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，檢測單倍型間的進化關(guān)系，并進行中性檢驗和錯配分析，推測種群的平衡狀態(tài)以及種群事件時間［19］。

表1 棘頭梅童魚采樣信息Tab.1 Sampling details of C.lucidus

2 結(jié)果與分析

2.1 D-loop區(qū)序列分析

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序及序列比對得到795 bp的D-loop基因序列，7個群體的線粒體控制區(qū)堿基組成基本一致，A、T、C、G平均含量分別為31.04%、31.43%、23.99%和 13.54%，A＋T含量（62.47%）明顯高于 G＋C含量（37.53%），與大多數(shù)脊椎動物線粒體DNA的堿基組成相似，體現(xiàn)出顯著的AT堿基偏好性［20］。208條序列共檢測到66個變異位點，存在4個插入／缺失現(xiàn)象，轉(zhuǎn)換顛換比 K嘌呤＝4.99，K嘧啶＝7.813，整體 R＝2.845。

2.2 遺傳多樣性分析

7個群體共檢測到83種單倍型，未發(fā)現(xiàn)所有群體的共享單倍型，每個群體均有獨享單倍型，其中CM群體最多，有17個獨享單倍型（表2）。CM、LYG、DF和 ZS群體之間存在共享單倍型Hap1，占所有個體的22.12%，WZ、ND和 XM群體之間存在兩個優(yōu)勢單倍型Hap45和Hap47，共占整體的23.08%。從單倍型分布可以看出7個群體之間存在地理上的分化現(xiàn)象。

群體的遺傳多樣性參數(shù)見表3。單倍型參數(shù)方面，CM和WZ群體的單倍型數(shù)目及單倍型多樣性較高，分別為20（0.954 00±0.000 67）和19（0.948 00±0.000 77），XM群體的單倍型數(shù)目和單倍型多樣性最低，僅為 7（0.554 00±0.009 98）。核苷酸參數(shù)方面，DF群體的核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)最高，分別為0.007 08和5.621，XM群體最低，分別為0.001 83和1.448。由以上結(jié)果可見，CM、WZ和DF群體遺傳多樣性高，而XM群體的遺傳多樣性最低。

表2 棘頭梅童魚7個群體單倍型分布情況Tab.2 Distribution of haplotypes among 7 populations of Collichthys lucidus

·續(xù)表·

·續(xù)表·

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)

棘頭梅童魚不同群體內(nèi)遺傳距離在0.002～0.007之間，其中DF群體的內(nèi)部遺傳距離最大，XM群體內(nèi)部遺傳距離最?。ū?）。兩兩群體間的遺傳距離在0.004～0.039的范圍內(nèi)，LYG、DF、CM和ZS 4個群體之間的遺傳距離及WZ、ND和XM 3個群體之間的遺傳距離較小，在0.004～0.007之間，而兩組群體間的遺傳距離在0.036～0.039之間，說明7個棘頭梅童魚群體之間明顯分為兩支，即北方群體（LYG、DF、CM和ZS）和南方群體（WZ、ND和XM）。

7個棘頭梅童魚群體間遺傳分化結(jié)果如表4所示，兩兩群體的遺傳分化系數(shù) Fst值在-0.008 72～0.928 28之間。DF和 LYG群體的Fst值為 -0.008 72，遺傳分化程度極低；CM、ZS群體和DF、LYG群體兩兩之間的Fst值屬于中度遺傳分化；ND、WZ和XM群體之間的Fst值均在0.05之內(nèi)，屬于低度遺傳分化；DF、LYG、CM和ZS群體與其它3個群體間的Fst值均大于0.8，說明兩組地理群體間遺傳結(jié)構(gòu)存在顯著的差異。

基于Fst值計算出群體間的基因流Nm，LYG、DF、CM和ZS群體兩兩之間的Nm值均大于1，與其它3個群體的Nm值極??；WZ、ND和XM群體兩兩之間的結(jié)果一致（表5）。

上述結(jié)果作為依據(jù)，將7個棘頭梅童魚群體分為2組，進行遺傳差異的分子方差分析?？偟姆讲罘譃榻M間方差組分（Va）、組內(nèi)群體間方差組分（Vb）和群體內(nèi)方差組分（Vc），如表6所示，組間變異為85.97%，組內(nèi)群體間變異占0.68%，群體內(nèi)變異為 13.35%，遺傳分化指數(shù) Fst＝0.866 47（P＝0）。

表3 棘頭梅童魚D-loop區(qū)遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of mt DNA D-loop region in Collichthys lucidus

表4 棘頭梅童魚群體內(nèi)遺傳距離（對角線，粗體）及兩兩群體間遺傳距離（對角線上）和遺傳分化系數(shù)（F st）（對角線下）Tab.4 Pairwise genetic distances within population（diagonal，bold），and genetic distance（above diagonal），fixation index（F st）（below diagonal）between every two populations of Collichthys lucidus

表5 棘頭梅童魚群體間的基因流Tab.5 Gene flow value between populations of Collichthys lucidus

表6 棘頭梅童魚群體間遺傳差異分子方差分析Tab.6 Analysis of molecular variance（AMOVA）of populations of Collichthys lucidus

2.4 單倍型鄰接關(guān)系樹和簡約網(wǎng)絡(luò)圖

為了更直觀地闡述群體間的遺傳結(jié)構(gòu)，以中介鄰接網(wǎng)絡(luò)法構(gòu)建了棘頭梅童魚單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），單倍型被分為3部分，其中兩部分分別以Hap1和Hap47為中心呈典型的星狀分布態(tài)勢逐級拓展，另一部分作為過渡單倍型存在。Hap1存在于LYG、DF、CM和 ZS群體中，Hap47存在于WZ、ND和XM群體中。

圖2 基于D-loop區(qū)構(gòu)建棘頭梅童魚單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.2 Haplotype network diagram constructed based on D-loop region of Collichthys lucidus注：連云港：粉色；大豐：黃色；崇明：藍色；舟山：綠色；寧德：紫色；溫州：黑色；廈門：白色Note：LYG：Pink；DF：Yellow；CM：Blue；ZS：Green；ND：Purple；WZ：Black；XM：White

以單倍型構(gòu)建鄰接關(guān)系樹，大部分節(jié)點分支的支持率均大于50%，具有顯著的地理譜系結(jié)構(gòu)（圖3）。鄰近關(guān)系樹中大致分為兩個區(qū)域，結(jié)合表2可知，區(qū)域1的單倍型基本出現(xiàn)在LYG、DF、CM和ZS群體中；區(qū)域2的單倍型基本出現(xiàn)在WZ、ND和XM群體中，有少數(shù)ZS群體個體出現(xiàn)。單倍型鄰接關(guān)系樹和單倍型簡約網(wǎng)絡(luò)圖將7個棘頭梅童魚群體分為2個地理群體，與遺傳距離分析和Fst值所得結(jié)論一致。

2.5 中性檢驗和錯配分析

棘頭梅童魚群體中性檢驗包括Tajima’s D和 Fu’s Fs分析，如表3所示，Tajima’s D的檢測結(jié)果均為負值，ZS和ND群體顯著，其余群體不顯著；Fu’s Fs檢驗結(jié)果中，除DF為正值外，其它均為負值，且僅ND群體顯著。上述結(jié)果表明，各個群體，尤其是ND和ZS群體，符合中性模型，選擇壓力小，可能經(jīng)歷了種群的規(guī)模性擴張或定向選擇。錯配分析結(jié)果如表7所示，整體的SSD值為0.161 42（P＞0.05），各個群體的值在 0.005 29～0.658 15之間，Rag整體值為0.040 71（P＞0.05），說明棘頭梅童魚仍處于膨脹階段，為棘頭梅童魚種群擴張?zhí)峁┝俗C據(jù)。

3 討論

棘頭梅童魚廣泛分布于中國沿海，且以黃海、東海為主。本研究選取連云港、大豐（黃海），崇明、舟山、溫州、寧德和廈門（東海）7個地理群體的208個樣本，利用線粒體控制區(qū)（D-loop）對棘頭梅童魚遺傳多樣性進行分析。

圖3 基于Kimura 2-Parameter模型構(gòu)建單倍型的NJ樹Fig.3 NJ clustering diagram of haplotypes constructed based on Kimura 2-Parameter model

遺傳多樣性是生物多樣性的核心，是物種生存與進化的基礎(chǔ)，其中核苷酸多樣性是分析群體遺傳多樣性的重要指標，與單倍型多樣性共同反映線粒體DNA的變異程度［21］。本研究7個群體共發(fā)現(xiàn)83種單倍型，其中70種獨享單倍型，分布于各個群體，無所有群體共享的優(yōu)勢單倍型，這與殷麗娜［12］研究結(jié)果相似，棘頭梅童魚的短距離洄游特性是造成無共享單倍型、多獨享單倍型的主要原因。7個群體的總體遺傳多樣性高（h＝0.913，π＝0.014 11），且核苷酸多樣性與平均核苷酸差異數(shù)呈現(xiàn)一致的變化趨勢，說明中國沿海的棘頭梅童魚遺傳資源豐富，對環(huán)境的適應能力及進化潛力大。7個群體中，XM群體的遺傳多樣性最低（h＝0.554，π＝0.001 83），根據(jù) GRANT等［22］對海水魚類遺傳多樣性劃分的分布模式，判斷XM群體接近第一種模式（低h低π），說明XM群體近期出現(xiàn)過種群瓶頸效應或種群由單一、少數(shù)系群所發(fā)生的奠基者效應形成，導致其遺傳多樣性偏低。其余群體均符合第二種模式（高h低π）特點，說明群體受到了環(huán)境變化的影響，經(jīng)歷了快速的擴張期，種群數(shù)量急劇增加，堿基的突變導致單倍型數(shù)量和單倍型多樣性的增加，而核苷酸多樣性沒有獲得足夠的時間積累。Tajima’s D、Fs中性檢驗以及錯配分析結(jié)果也證明了棘頭梅童魚經(jīng)歷了群體擴張，根據(jù)擴張參數(shù)τ和（3%～10%）／百萬年的D-loop區(qū)進化速率推算［12］，中國沿海棘頭梅童魚的群體擴張發(fā)生在3.87～12.9萬年前。

遺傳距離是衡量群體間和群體內(nèi)部遺傳關(guān)系的重要指標，遺傳距離的大小反映群體間親緣關(guān)系的遠近和群體內(nèi)差異程度［23-24］。本研究中群體內(nèi)部的遺傳距離在0.002～0.007之間，數(shù)值高低與核苷酸多樣性參數(shù)的變化趨勢一致。遺傳距離數(shù)值將7個群體以舟山為界，明顯的分為北方群體（LYG、DF、CM、ZS）和南方群體（WZ、ND、XM），兩組地理群體間遺傳差異顯著。北方群體中，除DF群體內(nèi)部遺傳距離大于其與ZS、CM和LYG群體的遺傳距離外，群體內(nèi)部的遺傳距離均小于或等于兩兩群體間的遺傳距離，說明DF群體內(nèi)部分化大，推測種群間出現(xiàn)了交叉；南方群體中，WZ和ND群體的內(nèi)部遺傳距離和兩群體間遺傳距離相等，說明兩群體間也存在明顯的交叉現(xiàn)象。遺傳分化系數(shù)Fst是衡量群體間遺傳分化程度的標準［25］，本研究的Fst結(jié)果與遺傳距離結(jié)果相呼應，均說明中國沿海棘頭梅童魚的遺傳結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的地理區(qū)域性，即南北分化格局現(xiàn)象，DF和LYG群體、ND和WZ群體的Fst均為負值，同樣驗證兩兩群體間存在明顯的交叉現(xiàn)象。WZ、ND和XM群體與北方群體的Fst值均大于0.82，且呈現(xiàn)地理位置上由北向南Fst值逐漸增加的趨勢，XM群體最大，其與北方群體的Fst差值大于0.9，此結(jié)果與殷麗娜［12］得出的結(jié)果一致，表明棘頭梅童魚在南北分化的基礎(chǔ)上，北方群體與南方群體地理距離越遠，基因交流逐漸趨于0，分化程度越高。

表7 棘頭梅童魚7個群體的錯配分析參數(shù)Tab.7 Mismatch distribution analysis for 7 Collichthys lucidus populations

基于以上南北分化結(jié)果，計算群體的基因流Nm，并進行AMOVA分析。Nm值越大，說明群體間的基因交流水平越高［26］。本研究中，南、北地理群體間的Nm＜0.1，地理群體內(nèi)部Nm＞2，根據(jù)WRIGHT［27］對 Nm值的劃分，認為南、北地理群體之間的基因交流極弱，可能由于遺傳漂變發(fā)生了分化；南、北地理群體內(nèi)部存在較強的基因流，群體間的遺傳分化較小。其中，DF和LYG群體、ND和WZ群體間的基因流是南北類群內(nèi)部基因流的10倍以上，進一步驗證遺傳距離中關(guān)于其種群間交叉的結(jié)論。AMOVA分析中，組間變異為85.97%，組內(nèi)群體間變異占0.68%，群體內(nèi)變異為13.35%，遺傳分化指數(shù) Fst＝0.866 47（P＝0），說明主要的遺傳變異來自于南、北兩個地理群體間，群體內(nèi)部也出現(xiàn)了一定程度的分化?；蛄鱊m和AMOVA分析進一步證實中國沿海棘頭梅童魚形成明顯的南北分化格局。

為了更直觀地表述棘頭梅童魚群體間的遺傳結(jié)構(gòu)，以單倍型為依據(jù)，構(gòu)建鄰接關(guān)系樹和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。鄰接關(guān)系樹中，83種單倍型被分為兩部分，結(jié)合單倍型分布情況可以看出，兩部分分別代表南方地理群體和北方地理群體（表2）。棘頭梅童魚7個群體中存在3種優(yōu)勢單倍型，Hap1（北方群體）、Hap45和Hap47（南方群體），分別在南、北地理群體中適應環(huán)境變化，穩(wěn)定存在。網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖分為主要的兩部分，分別以Hap1和Hap47為中心呈星狀分布態(tài)勢拓展，兩者結(jié)果相符。

以上結(jié)果均表明棘頭梅童魚存在明顯的南北分化格局。趙明等［28］、殷麗娜等［12］和鄭德峰等［29］分別利用 COI、D-loop和 AFLP分析棘頭梅童魚遺傳結(jié)構(gòu)，同樣推斷我國棘頭梅童魚存在南北分化格局；宋煒等［5］和梁述章等［30］分別利用核基因微衛(wèi)星和形態(tài)框架數(shù)據(jù)分析，未發(fā)現(xiàn)南北分化現(xiàn)象。分析方法、采集樣本時間、地點、數(shù)量、樣本生長狀況和分析方法等的不同應該是造成以上不同結(jié)論的主要原因。形態(tài)參數(shù)極易受到環(huán)境和樣本生長時期的影響，線粒體分子標記由于母系遺傳，易受到選擇壓力的影響，核基因?qū)ΨN群遺傳結(jié)構(gòu)的檢測更敏感［31］。棘頭梅童魚南北分化格局產(chǎn)生的原因大致可歸納為以下4點：1）洋流影響：舟山是臺灣暖流、日本寒流以及黃海冷流的交匯點，舟山以北主要受黃海冷流和日本寒流的影響，舟山以南受臺灣暖流的影響；2）在趙明等［28］、謝起浪等［32］的研究中，均發(fā)現(xiàn)溫州群體存在過度捕撈現(xiàn)象，一定程度上阻止了溫州及其以南海域的棘頭梅童魚前來舟山漁場覓食、產(chǎn)卵等；3）棘頭梅童魚是短距離洄游種，使群體間產(chǎn)生基因交流，又極大程度限制基因交流的強度；4）根據(jù)擴張參數(shù)推算棘頭梅童魚群體擴張時間在3.87～12.9萬年前，即更新世冰期，海平面下降導致邊緣海地區(qū)的物種種群分化且產(chǎn)生地理隔離。