許晶莉， 范艷萍， 高晶

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD)是一組以社會(huì)交往障礙、言語和非言語交流障礙、狹隘興趣、刻板行為為主要特征的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。近年來，ASD發(fā)病率顯著上升，2014年，美國疾病預(yù)防控制中心公布的最新ASD患病率為1/68，已占精神殘疾的首位[1]。目前，ASD的病因不明，越來越多的證據(jù)表明，遺傳因素在ASD的發(fā)病中起著重要作用[2]?；蛐酒夹g(shù)是生物芯片技術(shù)的一種，是生命科學(xué)領(lǐng)域里興起的一項(xiàng)高新技術(shù)，其在基因組的表達(dá)分析、遺傳疾病基因診斷、病原微生物的診斷等方面都有廣泛的應(yīng)用，是一種高效、大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的重要手段。本研究采用基因芯片技術(shù)對(duì)30例ASD患兒進(jìn)行檢測(cè)，旨在通過基因測(cè)序，探討ASD患兒的遺傳學(xué)特征。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年6月至2018年6月在深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院兒童保健科進(jìn)行康復(fù)的ASD患兒30例為觀察組，其中男18例，女12例；年齡4～6歲，平均(4.61±0.25)歲。同期選擇健康體檢兒童20例作為對(duì)照組，其中男12例，女8例；年齡4～6歲，平均(4.88±0.30)歲。兩組研究對(duì)象在性別、年齡方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《美國精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第5版中ASD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合孤獨(dú)癥譜系障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡4～6歲；(3)患兒家長知情同意。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)并發(fā)癲癇；(2)聽力異常；(3)發(fā)育性言語和語言發(fā)育障礙；(4)精神發(fā)育遲滯；(5)重大軀體和神經(jīng)系統(tǒng)疾??；(6)遺傳性疾病。

1.5 方法

1.5.1 標(biāo)本采集 使用EDTA采血管，收集全體受試兒童的血液標(biāo)本。

1.5.2 血液標(biāo)本提取DNA (1)將冰凍血在室溫下溶化；(2)取1 mL血液轉(zhuǎn)入一無菌的2 mL離心管中，加入等體積的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后12 000 r/min離心5 min，棄上清；(3)加入667 μL STE，24 μL的20% SDS，37 ℃水浴1 h；(4)加10 μL的20 g/L的蛋白酶K混勻，55 ℃水浴消化過夜(10～14 h)；(5)將消化的樣品加入等體積的Tris飽和酚，充分搖勻，12 000 r/min離心10 min；(6)將上層水相轉(zhuǎn)入另一無菌2 mL離心管中；再加入等體積的Tris飽和酚，充分搖勻，12 000 r/min離心10 min；(7)將上層水相轉(zhuǎn)入另一無菌2 mL離心管中；并加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，漩渦振蕩至充分混勻，12 000 r/min離心10 min；(8)將上層水相轉(zhuǎn)入另一無菌2 mL離心管中；并加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分振蕩混勻，12 000 r/min離心10 min；(9)將上清液轉(zhuǎn)移到另一無菌2 mL離心管中；加入2倍體積的冰乙醇，1/10體積醋酸鈉水平搖動(dòng)，直到可見絮狀DNA析出；(10)將樣品置-20 ℃冰箱冷凍30 min或冰浴15～20 min，取出后再次12 000 r/min離心10 min，使DNA沉淀；(11)用槍頭將DNA挑到另一無菌離心管中，用適量的70%乙醇洗滌并晃動(dòng)，以洗出DNA的雜質(zhì)；(12)倒出乙醇，將DNA用真空干燥或自然晾干，加入適量的TE緩沖液回溶，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 DNA檢測(cè) 將上述DNA進(jìn)行列微陣技術(shù)檢測(cè)，包括芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、雜交反應(yīng)。

1.5.4 信號(hào)分析 采用拷貝數(shù)分析算法分析拷貝數(shù)變化的共同特征，對(duì)全部受試兒童的3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因譜比較，尋找對(duì)照組與觀察組之間的顯著性基因表達(dá)差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3個(gè)SNP基因位點(diǎn)(re2711888、rs6967728、rs756505)的分型結(jié)果見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組基因表達(dá)譜比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 SNP基因位點(diǎn)的基因頻率(n)

3 討論

目前，ASD的病因不明。研究發(fā)現(xiàn)，ASD可能是一種多因素、多基因共同作用的誘發(fā)的疾病[4]。目前，在國內(nèi)ASD患兒的診斷一般都在2～3歲后，此時(shí)其臨床特征已經(jīng)非常明顯，從而失去了早期干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)。采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)ASD的致病基因，有助于早期識(shí)別ASD，使患兒得到早期診斷及干預(yù)。近年來的遺傳學(xué)研究大多集中在基因異常方面，很多學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了ASD的候選基因。對(duì)ASD的基因定位研究顯示，SHANK3、SLC25A12、SCN2A2及GABRA4等基因多態(tài)性可能是ASD的疾病候選基因[4-6]，并且基于染色體基因水平的分析也證實(shí)，1q21.1,15q13.3,16p11.2,22q13.3等區(qū)域的基因數(shù)變異可能與ASD相關(guān)[7-8]。

基因芯片,也叫DNA芯片或DNA微陣列，基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代創(chuàng)建并發(fā)展起來的一項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)[9]。雖然只有短短數(shù)十年時(shí)間，基因芯片技術(shù)已經(jīng)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展?；蛐酒夹g(shù)通過分析雜交信號(hào)，就可知道不同情況每個(gè)基因是否已表達(dá)及表達(dá)水平如何?；蛐酒夹g(shù)在尋找新基因、定量檢測(cè)大量基因表達(dá)水平、闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)制、診斷及治療方面都是很有價(jià)值的。近年來，基因拷貝數(shù)變異正不斷被應(yīng)用于遺傳性疾病研究。研究證實(shí)，基因拷貝數(shù)變異和表型變異緊密關(guān)聯(lián)，在物種的演化和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[10]。因此，采用基因芯片技術(shù)探討孤獨(dú)癥相關(guān)候選基因是可行的。

本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)ASD患兒基因表達(dá)譜的差異，原因可能如下：(1)表觀遺傳學(xué)的觀點(diǎn)認(rèn)為，在孤獨(dú)癥譜系障礙以及眾多其他疾病中，可能并不必定存在DNA水平的突變和異常，但是可能在基因調(diào)控水平(主要是甲基化或組蛋白作用)出現(xiàn)了異常，從而導(dǎo)致在DNA表達(dá)方面的異常；(2)樣本量過小，比較基因位點(diǎn)過少。在今后的研究中，我們將繼續(xù)探索，擴(kuò)大樣本量，并篩選更多的ASD相關(guān)候選基因及SNP位點(diǎn)，做進(jìn)一步的研究。