李佩春， 羅南， 李曉捷

眾多的病理解剖研究證實大多數(shù)的未成熟兒伴隨著損害擴散可最終發(fā)展成為腦白質的萎縮和巨腦室，還有一部分的臨床后遺癥是囊腔的形成和代償?shù)纳窠浤z質過多癥等，對于其中構成白質主要成分的有髓神經纖維的結構和功能的改變將是導致神經學異常及腦性癱瘓的主要病理學基礎[1-2]。如何解決中樞神經纖維的損傷后再生，一直是近些年來神經科學方面的熱點之一。而體視學作為一種新型形態(tài)學三維計量工具，能更好闡述神經超微解剖結構的變化[3-5]，目前對小兒腦損傷中白質損傷有髓神經超微結構的定量研究還沒有相關報道。本研究應用體視學技術探討早期干預及康復訓練對宮內感染致腦損傷仔鼠腦白質有髓神經纖維總體積的影響，來揭示其促進腦損傷患者運動功能康復的病理學機制，為臨床早期積極的應用環(huán)境康復療法治療發(fā)育期腦損傷提供基礎理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級Wistar大鼠75只，雌雄比例2∶1，雌性體質量230～260 g，雄性260～300 g，由佳木斯大學實驗動物中心提供；脂多糖(脂多糖血清型055：B5美國Sigma公司)；鋨酸(佳木斯電鏡中心購于英國)；透射電鏡(日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備與分組 于17時將Wistar大鼠以2∶1合籠，次日上午8時查陰道涂片，以查得精子為妊娠第0天，孕鼠另籠飼養(yǎng)。將受孕的36只大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組6只和脂多糖組30只。給孕第17天的脂多糖組孕鼠脂多糖450 μg/(kg·d)，連續(xù)2 d腹腔注射，而對照組孕鼠腹腔注射同劑量的生理鹽水。孕22 d前分娩的仔鼠為早產鼠。兩組均去除早產鼠。仔鼠出生后，取胎盤做蘇木精-伊紅染色觀察宮內感染情況。判斷標準為大量中性粒細胞浸潤。隨機選取對照組仔鼠6只為生理鹽水組，選取脂多糖組仔鼠12只分為干預組和非干預組各6只。3組仔鼠均于恒溫恒濕環(huán)境中，母乳喂養(yǎng)。

1.2.2 行為療法干預 (1)早期觸摸：將2日齡干預組仔鼠托至掌心，用毛刷從頭到尾勻速有力刷動，每次持續(xù)15 min，每日1次，同時給予聲音和燈光刺激，干預至14日齡。(2)豐富環(huán)境刺激：將7日齡干預組仔鼠每日暴露于豐富環(huán)境中2 h，每日1次。60 cm×45 cm×45 cm籠內放置不同顏色及形狀的物體，包括轉盤、管道、階梯、搖鈴、秋千、水面等，每周將環(huán)境改變2次，以造成新異刺激，干預至28日齡。非干預組、生理鹽水組分別飼養(yǎng)于20 cm×30 cm×45 cm標準籠內，不予干預。(3)康復訓練：將15日齡至4周齡干預組仔鼠進行康復訓練，每日1次。訓練方法:①跑籠訓練:采用圓形轉籠訓練器材，轉籠直徑25 cm，內徑5 cm，底座有一固定架，跑籠訓練可訓練大鼠的抓握、行走、奔跑等運動，每次10 min；②轉棒訓練:一根長150 cm，直徑4.5 cm的轉棒；中點固定于3 r/min轉動器上，順、逆時針交替轉動，每次10 min；③平衡木訓練:平衡木長170 cm，寬2 cm，平放距地面7 cm處，每次10 min?？捎柧毱胶夤δ?。

1.2.3 體視學方法 (1)心灌流固定經4%的水合氯醛腹腔麻醉后，用2%的多聚甲醛和2.5%的戊二醛混合固定液(pH 7.4)進行心灌流固定。去除頭骨、小腦、腦干，剪斷顱神經后將大腦完整取出。(2)用6%的瓊脂分別包埋左右大腦半球，待瓊脂凝固后，將大腦半球沿冠狀線切成1 mm厚的連續(xù)等距切片，隨機抽取每只仔鼠大腦一側半球，在抽取出的每個大腦半球中，每3張大腦切片抽取1張。(3)在抽取出的大腦組織薄片上隨機疊放等距測點框，在解剖顯微鏡下計數(shù)所有落在白質斷面上的測點，根據卡瓦列里原理計算出整個大腦白質的總體積。V(wm)=t×a(p)×∑p(wm)，式中V(wm)代表白質的總體積，a(p)為每一測點所對應的面積(0.25 mm2)，t為切片厚度1 mm，∑p(wm)所有的與白質重疊的計數(shù)。(4)在測點擊中白質的地方抽取白質組織塊，這樣可以保證每個部位抽中的概率都相等，平均每個大腦半球抽取3個白質組織塊，用球切法包埋組織塊以保證各個方向分布的神經纖維都有相同的抽樣概率，再用前述常規(guī)電鏡包埋法包埋白質組織塊。從包埋好的組織塊上隨機切取一張60 nm的超薄切片，隨機選擇3個視野并放大6 000倍拍照。(5)有髓神經纖維總體積：在6 000倍放大的照片上隨機疊加具有等距測點的透明測點框，計數(shù)落在整個白質區(qū)域內有髓神經纖維上的測點數(shù)。根據公式：V(mnf)=Vv×V(wm)計算出白質內有髓神經纖維總體積。式中V(mnf)代表有髓神經纖維總體積，Vv為有髓神經纖維的體積密度，而Vv=∑P(mnf)/∑P(wm)式中，∑P(mnf)為落在神經纖維上得測點數(shù)，∑P(wm)為落在整個白質內的測點數(shù)和V(wm)代表白質總體積。

1.2.4 超微標本制作流程 (1)組織切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，先用3%戊二醛固定2～4 h。(2)用0.1%磷酸緩沖液漂洗4 h以上，4 ℃，換5次漂洗液。分出小部分標本備用。(3)用1%鋨酸-0.1%二甲胂酸鈉緩沖液固定2 h。(4)用緩沖液或雙蒸水漂洗5 min。(5)用50%、70%、80%、90%乙醇、90%丙酮脫水10 min，100%丙酮3次，每次10 min。(6)臨時配制環(huán)氧樹脂包埋劑，按下列濃度浸透，丙酮：包埋劑=1∶1，浸1 h。丙酮：包埋劑=1∶3過夜。(7)用新鮮包埋劑包埋，加上編號標簽。(8)聚合：35 ℃過夜，60 ℃ 24～48 h。(9)切1～2 μm半薄切片，對照定位后，60～80 nm超薄切片。(10)切片染色：用醋酸鈾飽和水溶液染后再用枸櫞酸鉛染色。

2 結果

2.1 各組仔鼠腦白質有髓神經纖維總體積比較 見表1。

表1 各組仔鼠腦白質內有髓神經纖維總體積比較

注：與生理鹽水組比較，aP<0.01；與干預組比較，bP<0.01；與14 d比較，ct=-18.55，-10.76，-3.10，P<0.05。

表1結果表明，非干預組和干預組仔鼠14 d和28 d有髓神經總體積和白質總體積顯著低于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。非干預組仔鼠28 d有髓神經纖維和白質總體積顯著低于干預組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；干預組和非干預組仔鼠14 d有髓神經纖維和白質總體積比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。生理鹽水組和干預組28 d有髓神經纖維總體積顯著高于14 d，非干預組顯著低于14 d，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 各組白質有髓神經纖維透射電鏡結果 見圖1。

圖1 各組白質有髓神經纖維透射電鏡觀察情況(×6 000)

3 討論

早產兒腦室周圍白質軟化是指早產未熟兒由于某些原因導致的腦室周圍深部白質的缺血凝固性壞死。大量文獻表明，腦室周圍白質軟化是腦損傷及腦性癱瘓的主要神經病理改變，是影響存活患兒行為功能障礙和神經系統(tǒng)發(fā)育的最主要原因，由于腦白質主要由神經纖維及神經膠質細胞構成[6-7]，故研究干預措施對有髓神經纖維超微結構變化是目前研究的熱點。

體視學的應用使得經典的形態(tài)學觀察發(fā)生革命性變化，摒棄傳統(tǒng)的二維視角，把二維平面還原為三維立體，實現(xiàn)了細胞形態(tài)從定性研究走向定量法研究質的飛躍。Pakkenberg等[8]運用體視學方法測定老年的腦白質體積降低約28%，Marner等[9]在國際上首次闡述了定量研究大腦白質有髓纖維的體視學方法。但是在先天性腦損傷病中，國內外用體視學方法研究尚未見報道。

本實驗首次用體視學方法研究宮內感染致腦損傷的有髓神經改變進行了相關研究，研究結果如下：(1)生理鹽水組從生后14 d到發(fā)育的關鍵期28 d，白質總體積從原先的52.77 mm3到82.76 mm3，其中有髓神經纖維的總體積從原先的12.99 mm3到32.77 mm3。兩者的增長比例分別為38%和61.5%，體現(xiàn)了神經隨著生長呈現(xiàn)出一定的大體上的發(fā)育，而且大腦白質的變化主要由其中神經纖維的增長引起。(2)干預組第14天白質總體積較生理鹽水組減少24.6%而到28 d時的37.5%，有髓神經總體積相比下降34.4%到28日齡的57.8%。(3)非干預組第14天的白質總體積較同日齡生理鹽水組減少27%而到28 d時的60.9%，有髓神經總體積相比下降了43.5%到28日齡的81.3%。(4)干預組較非干預組比較有髓神經纖維總體積的增加有顯著差異。

在人類的早產兒腦損傷致死的尸檢報告中顯示，早期腦室周圍白質軟化，腦白質損傷區(qū)可見炎癥細胞在壞死區(qū)聚集現(xiàn)象，而在后期的改變主要以腦室周圍囊腔形成為特征，并囊腔周圍存在強烈的星型細胞增殖和纖維化。在本實驗研究中，第14天時干預組與非干預組的白質總體積比較無統(tǒng)計學意義，而有髓神經總體積有差異，提示腦損傷后由于白質內有髓神經纖維存在自身修復的緣故，通過側支長芽等方式促進受損神經再生和修復。基本與腦室周圍白質軟化早期損傷大體標本一致。同時在非干預組的投射電鏡中觀察到受損區(qū)存在再生修復的纖維結構形態(tài)(修復的纖維結構末端髓鞘較薄，而且形態(tài)不規(guī)則)，也證實了上述觀點。但在第28天的對比中發(fā)現(xiàn)，干預組與非干預組較同日齡的生理鹽水組相比結果分別為：有髓神經總體積減少的程度分別為58.3%和82.2%，說明非干預組自身增生的程度有限，而且隨著發(fā)育，有髓神經纖維的損傷將難以恢復或有加重的趨勢?？赡苁侵袠猩窠浻兴枭窠浝w維主要是由多個少突膠質細胞的胞突纏繞構成，而它可以在發(fā)育中具有纏繞髓鞘的能力，而且一直維持到成年。當在發(fā)生急性慢性脫髓鞘病變的時候，自身修復作用能使其一定程度上代償修復。如果不及時干預治療，隨著神經的發(fā)育，腦白質及其內的有髓神經纖維的損傷程度會呈現(xiàn)上述實驗中加重的趨勢。干預組能一定程度的促進神經再生，考慮主要的機制是：是由于康復訓練改變了腦組織中的微環(huán)境，增加樹突棘分支及密度，提高損傷區(qū)皮質突觸膜糖蛋白的表達及神經干細胞分化及遷移能力，抑制腦缺血再灌注導致的X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白mRNA表達，誘導損傷區(qū)神經生長因子、轉化生長因子等神經營養(yǎng)因子的表達，來影響大腦的再生修復，促進神經的可塑性。國內對短期豐富環(huán)境刺激對老年大鼠腦白質及白質內有髓神經的影響研究中，發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境對有髓神經纖維的總體積有一定的影響[10]。本研究與上述研究的結果基本一致。

由于觀察的時限較短，飼養(yǎng)食物量不同，實驗處理時纖維等物質的縮水率因素影響，本實驗中只是計算出神經纖維總體積的大體情況，而沒有把損傷中活躍增生的部分區(qū)別出來加以區(qū)別，為了研究宮內感染對腦白質損傷的長期影響，還需要大樣本，利用先進的標記技術做進一步的測量。