李雪彤 林英 張園 李穎 呂淑霞 許文濤
(1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,沈陽 110866;2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)(食用)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國農(nóng)業(yè)大學(xué),北京 100083;3. 中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 動(dòng)物產(chǎn)品安全檢測室,北京 102600)
食品安全是全球高度關(guān)注的、直接關(guān)系民生的公共衛(wèi)生安全問題,因此食品安全檢測變得尤為重要,食品安全的風(fēng)險(xiǎn)評估與檢測技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。
食品被食源性致病菌污染后,會引起食品的變質(zhì)腐敗,且食源性致病菌的生長會產(chǎn)生特定的毒素,直接或間接地導(dǎo)致患病。常見的食源性致病菌包括致病性大腸桿菌(Escherichia coli O157:H7及腸出血性菌株Escherichia coli O103:H25,O26、O111、O115、O128及O145)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 致 病 性 弧 菌(Vibriospp.)、 彎 曲 桿 菌(Campylobacterspp.)等。
傳統(tǒng)微生物方法需要包含分離、培養(yǎng)、顯微鏡檢測等步驟,雖然操作簡單且結(jié)果穩(wěn)定性好,但有幾個(gè)局限。第一,此方法至少需要24 h培養(yǎng)。第二,后續(xù)鑒定檢測繁瑣,無法滿足對食源性致病菌快速檢測的需求。
此外,以PCR為代表的核酸分子檢測技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對微生物的基因組DNA或RNA片段進(jìn)行高效識別。該方法最為靈敏準(zhǔn)確,廣泛用于病原體的檢測。但PCR檢測需要完好無損傷的微生物DNA或RNA[1],且無法區(qū)分活菌和死菌。此外,常規(guī)PCR檢測方法是需要合適的儀器、專業(yè)試劑及有經(jīng)驗(yàn)的人員。
以抗原抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法也發(fā)展迅速,這些特異性抗體是以病原體特有的蛋白質(zhì)或碳水化合物為靶標(biāo)。此方法包括凝集試驗(yàn)、ELISA、Western blot分析等。免疫法靈敏度高,但保存和處理抗體需要特定條件[2],以防止其變性。因此,發(fā)展快速、成本效益好、可靠性高的微生物檢測方法是十分必要的。如今,功能特點(diǎn)有望與抗體媲美的“核酸抗體”逐漸成為研究熱點(diǎn),我們稱這種核酸抗體為“適配體”。
適配體(aptamer),由拉丁語“aptus”(合適)與德語“meros”(部分)演化而來,是運(yùn)用SELEX技術(shù)從體外人工合成的隨機(jī)寡核苷酸庫中篩選得到的,能高親和、特異性識別靶標(biāo)物質(zhì)的一段寡核苷酸序列(DNA/RNA)。適配體的特異性和親和性與單克隆抗體類似。但與抗體相比,適配體具有其他大量優(yōu)點(diǎn):理論上幾乎任何靶標(biāo)(甚至是有毒的或無致免疫原性的)都有相應(yīng)的適配體;適配體體積比較小(是單克隆抗體全尺寸1/20-1/25),可提高組織滲透;適配體是一個(gè)相對穩(wěn)定的化合物,它可以通過標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸化學(xué)合成方法合成,必要時(shí)可以進(jìn)行不同的化學(xué)修飾,而修飾可以進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性,生物利用度和藥物動(dòng)力學(xué),或使其在使用過程中易于被固定或被標(biāo)記;與微生物表面的決定因素特異性結(jié)合的DNA或RNA適配體,可以作為新型檢測系統(tǒng)的識別元件;熱穩(wěn)定、化學(xué)穩(wěn)定、低成本、批次偏差小等這些特點(diǎn),使得基于適配體的方法有望代替免疫學(xué)方法。此外,高親和性和選擇性使適配體可以區(qū)分高相關(guān)性的靶標(biāo),如蛋白質(zhì)不同亞型[3]。
適配體生物傳感器是利用適配體獨(dú)特的立體結(jié)構(gòu)可與靶標(biāo)微生物特異性結(jié)合的原理,以適配體作為識別元件,與適當(dāng)?shù)男盘栟D(zhuǎn)換器相結(jié)合,轉(zhuǎn)變?yōu)殡?、光、聲等可識別的信號,實(shí)現(xiàn)對食源性致病菌檢測的生物傳感器。
由于適配體篩選可以在實(shí)際檢測模擬條件下進(jìn)行,這對環(huán)境和食品樣品中微生物的檢測極其有利。在不影響其親和力的情況下,可以對適配體改造以便固定化和標(biāo)記報(bào)告分子。與抗體相比,適配體更容易被化學(xué)修飾和標(biāo)記;并且作為核酸序列,可進(jìn)行變性和復(fù)性的重復(fù)循環(huán);這使得固定化生物組件功能可以再生利用[4-5]。
本綜述主要介紹食源性致病菌SELEX技術(shù)、食源性致病菌適配體及其適配體生物傳感器在食源性致病微生物檢測中的研究進(jìn)展,旨在為微生物檢測方法開拓新領(lǐng)域,指引新方向。
指數(shù)富集配體進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),其基本方案包括3個(gè)主要階段:文庫和靶標(biāo)進(jìn)行孵育,適配體-靶標(biāo)復(fù)合物與未結(jié)合寡核苷酸的分離,適配體的擴(kuò)增(圖1-A)?;赗NA文庫的SELEX另包括以下步驟:在體外轉(zhuǎn)錄獲得一個(gè)RNA文庫,對結(jié)合靶標(biāo)的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增(圖 1-B)。
在篩選過程中,文庫中具有較高靶標(biāo)親和性的序列被富集。雖然能很快獲得一些適配體,但大多需要5-15輪SELEX。在篩選后,對富集的序列進(jìn)行克隆、測序,以確定每條適配體的序列。通過適配體的結(jié)構(gòu)分析,找到共有區(qū),以確定適配體與靶標(biāo)結(jié)合所需的最小尺寸及適配體與靶標(biāo)的親和性。
到目前為止,SELEX技術(shù)應(yīng)用于廣泛的靶標(biāo),包括純化蛋白質(zhì)、小分子、活細(xì)胞、組織和微生物。
圖1 DNA文庫的SELEX基本方案(A)RNA文庫的SELEX基本方案(B)[6]
傳統(tǒng)上,可溶性蛋白質(zhì)純化是SELEX中最常使用的靶標(biāo)?;诩兓鞍椎腟ELEX方法被廣泛應(yīng)用的原因是其操作非常簡單,可以在控制的條件下進(jìn)行。但這種篩選是在非生理環(huán)境下完成的,重組蛋白往往不能折疊成正確的結(jié)構(gòu)。因此,篩選的適配體可能不與天然構(gòu)象的靶標(biāo)識別。為了克服這個(gè)局限,以完整活細(xì)胞(cell-SELEX)作為一個(gè)復(fù)雜靶標(biāo),使得適配體的篩選過程可以在生理環(huán)境中進(jìn)行。與基于蛋白質(zhì)的SELEX技術(shù)相比,cell-SELEX過程中所有分子都處于其天然折疊結(jié)構(gòu)和分布,這種方法可以提高在體內(nèi)成功篩選適配體的可能性。
因此,cell-SELEX成為篩選細(xì)胞表面蛋白適配體的首選。其另一個(gè)優(yōu)勢是,對特定細(xì)胞類型的適配體進(jìn)行篩選時(shí),無需對其特定靶標(biāo)有先驗(yàn)知識,這就導(dǎo)致可能得到多種識別特殊細(xì)胞表型的適配體,或發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞生物標(biāo)記物。到目前為止,已篩選出一些不同細(xì)胞類型和其他復(fù)雜系統(tǒng)的適配體,如不同血清型的細(xì)菌。
1997年,首次基于SELEX技術(shù),利用磁珠固定靶標(biāo)進(jìn)行適配體篩選[7]。在此方法中,靶標(biāo)大多為蛋白質(zhì),將蛋白質(zhì)固定在磁珠上,與適配體結(jié)合后,通過磁分離,獲得結(jié)合的適配體。2005年,有人提出了比磁珠-SELEX更加方便簡單的FluMag-SELEX方法[8],此方法基于磁珠-SELEX,引入熒光標(biāo)記的引物,經(jīng)歷PCR擴(kuò)增后,使磁珠上靶標(biāo)結(jié)合的適配體帶有熒光基團(tuán)。在FluMag-SELEX基礎(chǔ)上發(fā)展了一種新方法,與前兩種基于磁珠的SELEX方法不同,capture-SELEX 是將DNA文庫修飾在磁珠上,這種方法有利于小分子靶標(biāo)適配體的篩選。磁珠-SELEX與微流體結(jié)合,開發(fā)一種自動(dòng)化平臺,用于快速獲得高靶標(biāo)親和性的適配體。
SELEX技術(shù)最常用的變型是毛細(xì)管電泳-SELEX(CE-SELEX)[9],這種方法的原理是根據(jù)電泳遷移率來將適配體-靶標(biāo)復(fù)合體與未結(jié)合序列分離。與傳統(tǒng)方法相比,CE-SELEX可以大幅度降低篩選輪數(shù)。微自由流動(dòng)電泳-SELEX技術(shù)(μFFE)[10]是CE-SELEX的改進(jìn)技術(shù),與傳統(tǒng)SELEX和CESELEX相比,適配體的分離效率顯著提高,這便于降低樣本的使用量,降低實(shí)驗(yàn)成本。
為了降低篩選輪數(shù),一系列One-step SELEX技術(shù)陸續(xù)被開發(fā),如MonolEX、NanoSelection等。MonolEX[11]是一種基于親和層析方法的SELEX技術(shù),其原理是將靶標(biāo)固定在樹脂上,親和力強(qiáng)的適配體保留在樹脂,而未結(jié)合序列被洗脫。NanoSelection的原理[12]是攜帶熒光標(biāo)記寡核苷酸的粒子與固定在蓋玻片的靶標(biāo)孵育結(jié)合,通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢測,在原子力顯微鏡下對結(jié)合的適配體進(jìn)行提取。
適配體的寡核苷酸序列中間為20-60 nt隨機(jī)序列,其中不同的序列具有不同的構(gòu)象和結(jié)合能力。使用短的(<50堿基)SELEX文庫,其優(yōu)勢是,較短適配體可以高效的、便宜的、通過化學(xué)合成得到,同時(shí)也減少了文庫的復(fù)雜性,降低了限制篩選的有效性。隨機(jī)區(qū)域兩側(cè)通常是兩個(gè)恒定序列,用于與引物結(jié)合,進(jìn)行PCR擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄(RNA文庫)。在文庫的設(shè)計(jì)上,引物區(qū)序列的長度是一個(gè)重要的部分。為開發(fā)片段較短的適配體,構(gòu)建短的或無引物序列的文庫越來越備受關(guān)注。此外,由于引物可能覆蓋適配體序列總長度的一半以上,因此會很大程度上影響適配體的復(fù)雜性和適配體與靶標(biāo)的結(jié)合能力。引物區(qū)采用較短序列(7-10個(gè)核苷酸)的方法已經(jīng)開發(fā)出來。這些方法包括利用自身互補(bǔ)序列來隔絕恒定區(qū)域的序列,從而減少引物區(qū)對適配體與靶標(biāo)結(jié)合的影響。有學(xué)者提出構(gòu)建基于酶反應(yīng)的無引物區(qū)的文庫[13-14]。例如,Pan等[13]使用雙鏈DNA核酸內(nèi)切酶劈裂去除每個(gè)SELEX周期前的引物,在每輪篩選后再與引物連接重組為文庫。
本文總結(jié)了目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中報(bào)道的較為常見的食源性致病菌適配序列(表1-表3)。
在文庫設(shè)計(jì)上,另一個(gè)需要考慮的因素是RNA或單鏈DNA的選擇。一般來說,DNA文庫擴(kuò)增過程比RNA文庫簡單,并且DNA寡核苷酸更穩(wěn)定和便宜。
RNA文庫與DNA文庫相比具有以下一些優(yōu)勢。首先,RNA分子更靈活,具有更高的折疊復(fù)雜性。此外,RNA適配體對細(xì)胞核酸酶更加敏感,引入化學(xué)修飾的保護(hù)基,以達(dá)到相對的穩(wěn)定,甚至比ssDNA更好。適配體化學(xué)修飾最常見的方法是在核糖2′端引入取代基和對磷酸核糖骨架進(jìn)行修飾。在SELEX過程中,由于與酶促反應(yīng)的兼容,2′- 氟代和2′ - 氨代核苷可以被引入到初始文庫。
如今,適配體與靶標(biāo)結(jié)合所需最小長度的研究越發(fā)被關(guān)注。Lee[41]對E .coliO157:H7特異結(jié)合的RNA適配體I-1,根據(jù)預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行劈裂,形成3個(gè)適配體衍生物:“長莖環(huán)結(jié)構(gòu)”、“短莖環(huán)結(jié)構(gòu)”及由長短莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成的“兩莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。其中,“長、短莖環(huán)結(jié)構(gòu)”均與靶標(biāo)無法結(jié)合,但“兩莖環(huán)”結(jié)構(gòu)特異性識別E .coliO157:H7。
Chinnappan等[42]對基于 Kolovskaya篩選的適配體進(jìn)行劈裂,獲得解離常數(shù)為3.2 nmol/L的劈裂適配體,并以此構(gòu)建檢測腸炎沙門氏菌的熒光共振轉(zhuǎn)移傳感器,其檢測限為25 CFU/mL。
流式細(xì)胞術(shù)是一種基于激光的方法,能夠具有高重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性的表征分子的物理特性和化學(xué)特性[43]。因此,流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)成為在表征適配體結(jié)合親和性方面最常用的方法之一,一股單細(xì)胞懸濁液依次通過檢測裝置,來檢測細(xì)胞群中被標(biāo)記的細(xì)胞。結(jié)合相互作用是由標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度決定,其熒光強(qiáng)度高表明適配體與靶標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合能力強(qiáng)。直方圖和點(diǎn)狀圖是流式細(xì)胞儀的兩個(gè)主要輸出方式,其中點(diǎn)狀圖可同時(shí)顯示不同適配體與不同類型細(xì)胞結(jié)合的比較情況。目前,已經(jīng)有研究利用流式細(xì)胞術(shù),對適配體的結(jié)合力進(jìn)行表征,這些適配體是利用不同靶標(biāo)篩選得到的,如E. coliO157∶H7[20]、鼠傷寒沙門氏菌[25]、副溶血弧菌[32]、空腸彎曲菌[37]、A 族 M 型鏈球菌[44]、嗜酸乳桿菌[45]等。
表1 食源性致病菌DNA適配體
表2 食源性致病菌RNA適配體
表3 食源性致病菌劈裂適配體
紫外-可見吸收法(UV-Vis)是對適配體及其靶標(biāo)結(jié)合特性進(jìn)行表征的方法。通過同濃度適配體下,不同濃度的靶標(biāo)的吸光值的改變來估算Kd值,但目前此方法應(yīng)用較少。
熒光分光光度計(jì)可以通過對標(biāo)記熒光基團(tuán)的適配體與適配體結(jié)合熒光強(qiáng)度的檢測,繪制解離曲線,以此來獲得解離常數(shù)Kd值。由于熒光分光光度計(jì)使用較廣泛,該方法得到廣泛使用,在鼠傷寒沙門氏菌[26,46]、金黃色葡萄球菌[29]等均有應(yīng)用。
類似于傳統(tǒng)的、用于特定物質(zhì)檢測的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),可以將適配體偶聯(lián)到酶聯(lián)分析中,以確定其結(jié)合親和力。1996年,Drolet[47]首次報(bào)道,這種方法分析適配體結(jié)合力的靈敏度高且可進(jìn)行定量。因此,酶聯(lián)分析也被常用來表征基于cell-SELEX方法獲得的適配體結(jié)合親和力,并應(yīng)用于研究全細(xì)胞、細(xì)胞裂解液或細(xì)胞分泌物及分泌物裂解物。
閃爍計(jì)數(shù)對放射性標(biāo)記樣品的檢測具有高靈敏度,這使得閃爍計(jì)數(shù)成為檢測適配體與其靶標(biāo)細(xì)胞結(jié)合反應(yīng)的有力工具。為準(zhǔn)確測量適配體結(jié)合親和性,分離結(jié)合靶標(biāo)與未結(jié)合靶標(biāo)的適配體是必不可少的,分離過程可以通過過濾或離心實(shí)現(xiàn)。基于閃爍計(jì)數(shù)的適配體結(jié)合分析被應(yīng)用于32P標(biāo)記的RNA適配體,此適配體與傷寒血清型沙門氏菌的pil操縱子編碼的IVB型菌毛特異結(jié)合,通過硝化纖維膜對結(jié)合反應(yīng)物過濾,對硝化纖維膜上的適配體-靶標(biāo)進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)[48]?;陂W爍計(jì)數(shù)法對32P標(biāo)記的DNA適配體與金黃色葡萄球菌細(xì)胞的結(jié)合力進(jìn)行考察,結(jié)果顯示,與靶標(biāo)結(jié)合的適配體通過閃爍計(jì)數(shù)方法被量化[28]。
雖然不是半定量,但共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡是用來監(jiān)測適配體與細(xì)胞結(jié)合的最常用的工具,它可以從視覺上直觀顯示適配體與其靶標(biāo)細(xì)胞的特異性。同時(shí)熒光和共聚焦顯微鏡在熒光信號激發(fā)和發(fā)射的原理上是相似的,但共聚焦顯微鏡具有視野深度控制的能力,減少背景,并可以獲得連續(xù)光學(xué)切片。目前,已經(jīng)應(yīng)用熒光和共聚焦顯微鏡來表征一些適配體的結(jié)合親和性和特異性,如甲型副傷寒沙門氏菌[27]、空腸彎曲菌[37]、鼠傷寒沙門氏菌[49]等?;罴?xì)胞和染色細(xì)胞均可用于熒光和共聚焦顯微鏡,而熒光信號的獲得,可以直接在適配體上引入熒光標(biāo)記,或間接地利用熒光標(biāo)記抗體靶向一個(gè)在適配體上的特定標(biāo)簽。熒光圖像通常顯示一個(gè)細(xì)胞可結(jié)合多個(gè)適配體,如金黃色葡萄球菌[28]。
原子力顯微鏡(Atomic force microscope,AFM)是一種基于掃描探針的顯微鏡技術(shù),用解析技術(shù)對大分子進(jìn)行高分辨率成像,并在生理?xiàng)l件下測量單分子水平的雙分子相互作用力。AFM無需對樣品固定及脫水,可以在水溶液條件及其潛在形態(tài)下進(jìn)行觀察細(xì)胞。這種特性,使得AFM適用于對活細(xì)胞表面蛋白及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。AFM的分析可以在力直方圖和拓?fù)鋱D像中進(jìn)行。黏附(pN)測定的直方圖峰值用于估算適配體與靶標(biāo)之間的親和力。pN值越高,結(jié)合力越大,這就意味著結(jié)合親和力越好。拓?fù)涑上耧@示靶標(biāo)表面構(gòu)象,從而以圖片形式,顯示適配體的結(jié)合如何改變靶標(biāo)表面構(gòu)象。在金表面修飾適配體,利用AFM動(dòng)態(tài)力顯微鏡(DFS)測定適配體與沙門菌的相互作用力,并首次在沙門氏菌表面測定單個(gè)外膜蛋白的位置[50]。
表面等離子共振(Surface plasmon resonance,SPR)技術(shù)是一種高通量、無標(biāo)記、實(shí)時(shí)技術(shù),用于表征適配體與其靶標(biāo)的結(jié)合親和力。Ahn等[33]利用表面等離子共振技術(shù)對篩選獲得的副溶血弧菌適配體的親和性進(jìn)行表征。生物素標(biāo)記的適配體通過與鏈霉親和素耦合的方式,修飾到SA芯片上,加入副溶血弧菌后,檢測SPR信號強(qiáng)度來衡量親和力。
高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)技術(shù)可以定性和定量地分析適配體與靶標(biāo)的結(jié)合。其原理是先將適配體固定在吸附柱上,在加壓條件下,使液體溶劑流通吸附柱,色譜圖顯示分析物濃度及保留時(shí)間,根據(jù)適配體、靶標(biāo)、適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的平衡分布來估算Kd 值[51]。
等溫滴定量熱法(Isothermal titration calorimetry,ITC) 和 微 尺 度 熱 泳(Microscale thermophoresis,MST)都是與熱力學(xué)相關(guān)的技術(shù),適用于表征適配體與其靶標(biāo)之間的親和力。等溫滴定量熱法中,指定濃度的適配體或靶標(biāo)作為滴定標(biāo)準(zhǔn)液,被加入不同濃度的互補(bǔ)分子中,此互補(bǔ)分子為分析物。當(dāng)三元復(fù)合物形成是唯一放熱過程時(shí),細(xì)胞溫度與對照細(xì)胞溫度保持一致,并避開所有放熱源。利用等溫滴定量熱法,基于細(xì)胞相對能量變化,對適配體-靶標(biāo)結(jié)合進(jìn)行表征,能量變化與結(jié)合量成正比[52]。
實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或加入熒光探針,利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析。Ahn等[33]在對每一輪SELEX產(chǎn)物的親和性表征時(shí),利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù),通過對Ct值大小的比較,來間接衡量適配體與靶標(biāo)菌的親和力。
目前,食源性致病細(xì)菌的適配體傳感器主要包括:電化學(xué)傳感器、光學(xué)傳感器、壓電晶體傳感器、橫向色譜法測試條等,其中電化學(xué)適配體傳感器與光學(xué)適配體傳感器應(yīng)用最為廣泛,因此圍繞這兩種傳感器進(jìn)行重點(diǎn)闡述。
本文總結(jié)了目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中報(bào)道的、較為常見的食源性致病細(xì)菌適配體傳感器(表4-表5)。
4.1.1 電極修飾適配體傳感器 在適當(dāng)條件下,將適配體修飾到電極表面,靶標(biāo)菌與適配體結(jié)合后,導(dǎo)致電極表面改變,從而導(dǎo)致電化學(xué)信號改變,如電流、電位、電導(dǎo)或阻抗。
電化學(xué)阻抗譜(Electrochemical impedance spectroscopy,EIS)是一種檢測電極表面界面性能變化的分析技術(shù),分析物與電極表面的檢測探針相互作用過后,使得電極表面界面性能改變。Peggy等[53]將Cao等[28]獲得的其中一條適配體,進(jìn)一步用于構(gòu)建電化學(xué)阻抗適配體傳感器。硫醇標(biāo)記ssDNA共價(jià)連接在金納米顆粒(Gold nanoparticle,AuNPs或GNPs)與還原型氧化石墨烯(Reduced graphene oxide,rGO)之間,將檢測探針固定在玻璃碳電極上修飾的AuNPs,用于捕捉金黃色葡萄球菌,從而導(dǎo)致阻抗急劇增加,檢測限為10 CFU/mL。
表4 食源性致病菌適配體傳感器
表4 續(xù)表
表5 多靶標(biāo)菌適配體傳感器
4.1.2 納米管適配體傳感器 碳納米管具有極好的電學(xué)特性、化學(xué)穩(wěn)定性、比表面積大等優(yōu)點(diǎn),因此它被廣泛應(yīng)用于生物傳感器,它的特性對于提高生物檢測的靈敏度和穩(wěn)定性具有巨大意義。段諾課題組[54]在其篩選獲得的沙門氏菌適配體基礎(chǔ)上,基于還原型氧化石墨烯(rGO)與多壁碳納米管(Multiwalled carbon nanotube,MWCNT),構(gòu)建一種電化學(xué)傳感器,其檢測限為25CFU/mL。
4.2.1 比色適配體傳感器 利用新型納米材料的顏色可變性構(gòu)建比色傳感器,搭載適配體的新型納米材料在溶液中呈分散狀態(tài),當(dāng)靶標(biāo)菌存在,適配體與之結(jié)合,使納米顆粒聚集從而顏色改變。常用金作為比色傳感器的指示劑,Yuan等[55]將適配體固定在微孔板中,加入靶標(biāo)菌與修飾適配體的AuNPs,形成適配體-靶標(biāo)菌-適配體-AuNPs三明治式復(fù)合體。通過加入銀離子實(shí)現(xiàn)顏色信號發(fā)大。
4.2.2 熒光適配體傳感器 熒光適配體傳感器主要有兩種,包括標(biāo)記和無標(biāo)記熒光傳感器。如今,熒光傳感器主要依賴于熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體或熒光納米顆粒標(biāo)記的適配體,通過靶標(biāo)菌與適配體結(jié)合后,熒光偏振信號的產(chǎn)生或熒光強(qiáng)度的改變,來檢測靶標(biāo)菌。熒光強(qiáng)度的改變可以通過在適配體的兩端標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán),當(dāng)存在靶標(biāo)菌時(shí),適配體構(gòu)象改變,從而引起熒光信號的改變。標(biāo)記熒光的方法困難、費(fèi)時(shí)且昂貴,因此,開發(fā)便利且無標(biāo)記的檢測方法變得十分必要。PicoGreen、SYBRGreen dye 與AccuBlue這些染料本身熒光十分微弱,然而與雙鏈 DNA結(jié)合時(shí)則具有高熒光性,但與單鏈DNA結(jié)合沒有明顯熒光變化。一種通用的熒光傳感器具有信號“開”和“關(guān)”兩種模式,這種傳感器是基于AccuBlue染料與適配體,用于鼠傷寒沙門氏菌的檢測[56]。量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)作為高效熒光納米材料,可以作為高通量生物物理分析技術(shù)來定量檢測細(xì)菌。量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記,適配體作為識別元件及熒光載體用于檢測靶標(biāo)菌(副溶血弧菌、鼠傷寒沙門氏菌)。發(fā)射光分別在535 nm與585 nm的雙色量子點(diǎn)分別連接兩種靶標(biāo)菌的適配體,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光信號檢測,其檢測限為5×103CFU/mL[57]?;陔p色量子點(diǎn)和碳納米顆粒(Carbon nanoparticles,CNPs)利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理,對鼠傷寒沙門氏菌與副溶血弧菌同時(shí)進(jìn)行檢測的傳感器,其檢測限分別為35 CFU/mL和 25 CFU/mL[58]。氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)是一種石墨烯制備的二維片層結(jié)構(gòu),具有優(yōu)越的物理性能,如良好的導(dǎo)電性、機(jī)械強(qiáng)度高、比表面積大、生物相容性及可調(diào)控的光學(xué)特性。氧化石墨烯是熒光共振轉(zhuǎn)移中良好的能量承載者,氧化石墨烯具有熒光淬滅的功能,是構(gòu)建傳感器的理想材料。
上轉(zhuǎn)換納米顆粒(Upconversion luminescent nanoparticles,UCNPs)作為熒光生物標(biāo)記物,具有重要的光學(xué)和化學(xué)特性,如使用時(shí)間長、高耐光漂白和光化學(xué)降解。Wu[59]基于三種不同顏色的上轉(zhuǎn)換納米顆粒,對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌和鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測,檢測限分別為25 CFU/mL、10 CFU/mL和15 CFU/mL。
4.2.3 化學(xué)發(fā)光適配體傳感器 化學(xué)發(fā)光是某些化學(xué)反應(yīng)伴隨的一種光輻射現(xiàn)象。因?yàn)闆]有外激發(fā)光源存在,從而沒有散射光背景干擾,因此具有靈敏度高、檢測區(qū)間寬等優(yōu)點(diǎn)。目前常見化學(xué)發(fā)光傳感器,常在適配體上標(biāo)記化學(xué)發(fā)光基團(tuán),或在適配體傳感器體系中引入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。楊明等[27]構(gòu)建一種基于非共價(jià)的自組裝檢測方法,單壁碳納米管(Single-walled carbon nanotube,SWNTs)與 DNA酶標(biāo)記的適配體檢測探針自組裝在一起,DNAzyme序列用于檢測信號的放大。當(dāng)靶標(biāo)菌與血紅素加入后,血紅素/G-四聯(lián)體形成,對化學(xué)發(fā)光(魯米諾與H2O2)的強(qiáng)度檢測實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)菌的定量,其檢測限為103CFU/mL。
4.2.4 表面增強(qiáng)拉曼光譜適配體傳感器 拉曼光譜是光子與分子相互碰撞發(fā)生方向和能量改變,從而產(chǎn)生散射光頻率變化的聯(lián)合散射光譜。為了增強(qiáng)光譜信號,對電極采用表面粗化的方法,即將分子吸附在粗糙金屬表面或納米粒子表面,從而獲得表面增強(qiáng)拉曼光譜。GNPs分別修飾MBA及DNTP,再將鼠傷寒沙門氏菌的適配體和金黃色葡萄球菌的適配體分別固定在兩種GNPs上,作為信號探針;將兩種靶標(biāo)菌的適配體分別修飾到磁性金納米顆粒(MGNPs),作為捕獲探針;當(dāng)靶標(biāo)菌存在時(shí),捕獲探針捕捉靶標(biāo)菌,形成GNPs-適配體-靶標(biāo)菌-適配體-MGNPs的夾心形式,通過拉曼增強(qiáng)光譜定量測定兩種靶標(biāo)菌檢測限分別為15 CFU /mL和35 CFU /mL[60]。
目前,對食源性致病菌與適配體的結(jié)合位點(diǎn)及原理并未深入探索,因此食源性致病菌適配體的篩選技術(shù)仍以cell-SELEX為主。未來更加深入研究靶標(biāo)與適配體的結(jié)合機(jī)制,對于構(gòu)建快速篩選適配體的體系具有巨大推進(jìn)作用。
食源性致病菌適配體生物傳感器是一個(gè)學(xué)科交叉的新型檢測方式,利用適配體傳感器檢測食源性致病菌目前仍局限于實(shí)驗(yàn)室,尚未應(yīng)用于實(shí)際檢測。其未來發(fā)展方向如下。
微生物單菌水平超靈敏檢測技術(shù)的開發(fā)。目前的靈敏度仍待進(jìn)一步提高,實(shí)際應(yīng)用的檢測限需達(dá)到1-10 CFU/mL水平。因此,利用各種信號放大手段來降低檢測線尤為重要。目前,已有學(xué)者利用核酸擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)信號放大,檢測限可低至1 CFU/mL[66]。
適配體與菌體表面識別機(jī)制有必要進(jìn)一步解析。大多數(shù)適配體傳感器是對某一靶標(biāo)菌檢測,適配體與菌的特異性取決于菌表面特定物質(zhì)還是取決于特定構(gòu)象,這些因素與菌的基因水平差異有何內(nèi)在聯(lián)系。有沒有可能依據(jù)微生物基因組信息未來直接開發(fā)預(yù)測出靠譜的適配體序列。
微生物種類太多,變異性較大,目前適配體篩選的陽性菌株選擇及陰性菌株選擇存在者很大的隨意性,后續(xù)有必要針對微生物的種屬分類特點(diǎn)來提出并制定微生物適配體篩選評價(jià)指導(dǎo)手冊或者規(guī)范,促進(jìn)該行業(yè)的快速發(fā)展。
微生物適配體的親和力評價(jià)手段很重要,不同方法結(jié)果不同,后續(xù)有必要開發(fā)適配體親和性計(jì)算的模型及評價(jià)手段,適配體的結(jié)構(gòu)裁剪規(guī)律同時(shí)也需要研究,以增強(qiáng)適配體的空間構(gòu)象的穩(wěn)定性,縮短適配體與靶物質(zhì)的構(gòu)象誘導(dǎo)的結(jié)合時(shí)間。