黃龍 吳本麗 何吉祥 陳靜 宋光同 汪翔 張燁 武松
(1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所,合肥 230031;2. 水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點實驗室,合肥 230031)
中華鱉生長性狀受肌肉發(fā)育等諸多遺傳和環(huán)境因素的影響。生長性狀的遺傳力低,傳統(tǒng)雜交改良周期長,尋找控制中華鱉生長性狀的主效基因及其遺傳標(biāo)記,使用標(biāo)記輔助選擇加快選育進(jìn)程,這對提高中華鱉生長性狀具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),MSTN基因?qū)χ腥A鱉肌肉生長具有調(diào)控作用[1],隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,新的生長性狀候選基因不斷被挖掘,如GRBP2基因和THSP基因[2]。同時,仍然有較多報道從基因功能來推測基因可能影響生長性狀,通過擴增多態(tài)位點進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析來證明SNP與生長性狀的關(guān)系,如IGF2基因[3]和GHRL基因[4]。這些研究使得生長性狀可利用的標(biāo)記不斷增加。
MyoD1(Myogenic differentiation 1) 是 生 肌 調(diào)節(jié)因子家族(MRFs)的重要成員,在肌形成早期階段參與決定肌形成的發(fā)生[5-6]。該基因與肌肉基因啟動子的特異性區(qū)域(E-BOX)相結(jié)合后激活肌肉特異性轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)肌前體細(xì)胞的增殖和分化,可使成纖維細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞,并最終分化為成熟肌纖維[7]。目前,在金頭鯛(Sparus aurata)[8]、 鱈(Gadus macrocephalus)[9]、 文 昌 魚(Branchiostoma belcheri)[10]、 黃 顙 魚(Pelteobagrus fulvidraco)[11]、 鱖 魚(Siniperca chuatsi)[12]和 長絲裂腹魚(Schizothorax dolichonema)[13]等水產(chǎn)動物已完成MyoD基因的克隆、序列分析和表達(dá)等研究。鑒于MyoD1基因是影響動物生長性狀的重要候選基因,且中華鱉MyoD1基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)研究尚未見報道,本研究通過直接測序法檢測MyoD1基因多態(tài)位點,以期獲得與中華鱉生長相關(guān)的SNP,為中華鱉分子標(biāo)記輔助選育奠定工作基礎(chǔ)。
本實驗中華鱉取自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所稻田養(yǎng)鱉基地,隨機選擇同批繁殖、同塊稻田養(yǎng)殖的2冬齡健康中華鱉共178只(其中雄性135只,雌性43只)。測量樣本體質(zhì)量、背甲長、背甲寬、腹甲長、腹甲寬、裙邊后側(cè)寬和體高7項生長指標(biāo)。同時剪取200 mg左右的裙邊組織,按照天根生化科技(北京)有限公司試劑盒說明書提取中華鱉組織DNA,使用瓊脂糖和紫外分光光度計測定DNA質(zhì)量和濃度,-20℃保存。2×TaqPCR master mix和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自寶生物(大連)工程有限公司;引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成;瓊脂糖為Sigma公司(美國)產(chǎn)品。
1.2.1MyoD1基因的擴增及突變位點基因分型 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的中華鱉MyoD1基因序列(GenBank登錄號:NW_005858157.1)設(shè)計4對引物(表1),以中華鱉基因組DNA為模板,采用PCR技術(shù)分別擴增MyoD1基因的各個片段。PCR擴增反應(yīng)總體積為20.0 μL,PCR反應(yīng)體系包括10.0 μL 2×TaqPCR master mix、上下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL、模板 DNA 0.5 μL,加 dd H2O 至 20.0 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性10 min;94℃變性30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸30 s,共進(jìn)行35個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物純化后送至生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對分析,獲得SNP位點。
表1 中華鱉MyoD1基因擴增引物
1.2.2 構(gòu)建連鎖圖譜 利用Haploview軟件進(jìn)行SNP位點間連鎖分析。
1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用Picalc程序包計算各位點的多態(tài)信息含量(PIC),利用Popgene 32軟件計算觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和哈溫平衡常數(shù)。采用SPSS 20軟件的GLM程序?qū)yoD1基因SNP與生長性狀的進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,因變量為中華鱉7項生長指標(biāo),自變量為篩選到的突變位點不同基因型。其生物統(tǒng)計模型為:Yij=μ+Gi+Sj+eij,式中,Yij表示某性狀第i個標(biāo)記在第j個個體上的觀測值,μ表示試驗觀測的所有個體平均值,Gi表示第i個標(biāo)記的基因型效應(yīng),Sj表示第i個標(biāo)記的性別效應(yīng),eij表示對應(yīng)個體觀測值的隨機殘差效應(yīng)。
通過序列比對,MyoD1基因有6個堿基位置發(fā)生突變,其中2個突變發(fā)生在啟動子區(qū)域(T-49G和A-38G),2個突變發(fā)生在內(nèi)含子1(C91T和A187T),1個位點突變發(fā)生在外顯子2(C880T),還有1個突變發(fā)生在外顯子2下游區(qū)域(T1522A)。其中,C880T位點為錯義突變,導(dǎo)致所編碼的氨基酸由丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V),核酸位置以所參考序列的第一個堿基為參考值1。等位基因頻率和基因型頻率,見表2。
對178只中華鱉MyoD1基因的6個SNP位點進(jìn)行分型,統(tǒng)計其遺傳參數(shù)(表2)。結(jié)果表明,多態(tài)信息含量(PIC)為0.168 9-0.373 0,期望雜合度(He)為0.186 8-0.497 4,有效等位基因數(shù)(Ne)為1.228 9-1.984 0,PIC和He多數(shù)處于0.25-0.50之間(除C880T位點),說明多數(shù)SNP位點具有中度多態(tài)性。經(jīng)卡方適合性檢驗,MyoD1基因除A187T 位點外,其余5個位點在中華鱉群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。
利用Haploview軟件對中華鱉群體的MyoD1基因的6個SNP位點進(jìn)行連鎖分析,并且構(gòu)建連鎖圖譜,結(jié)果如圖1可以看出,6個SNPs之間r2均沒有大于或等于0.8,說明中華鱉群體連鎖不緊密,沒有形成連鎖區(qū)塊,故按照單標(biāo)記分析進(jìn)行突變位點與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析。
表2 中華鱉MyoD1基因6個SNPs等位基因及基因型頻率
表3 中華鱉MyoD1基因SNP位點的遺傳多樣性參數(shù)
圖1 中華鱉MyoD1基因6個多態(tài)位點連鎖不平衡分析
采用一般線性模型分析中華鱉MyoD1基因6個多態(tài)位點不同基因型與生長性狀的相關(guān)性(表4)。T-49G位點不同基因型個體間的背甲寬存在顯著差異(P<0.05),突變型(GG)顯著大于野生型(TT),為優(yōu)勢基因型;A-38G位點不同基因型個體間的背甲寬存在顯著差異(P<0.05),突變型(AG)顯著大于野生型(AA),為優(yōu)勢基因型;A187T位點不同基因型個體間的體高存在顯著差異(P<0.05),突變型(TT)顯著大于野生型(AA),為優(yōu)勢基因型;T1522A位點不同基因型個體間的體質(zhì)量存在顯著差異(P<0.05),突變型(AA)顯著大于野生型(TT)和雜合型(TA),為優(yōu)勢基因型。
表4 中華鱉MyoD1基因與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析
基因組中的SNPs多數(shù)位于非編碼區(qū)域,因受到選擇壓力較小容易積累變異,而外顯子變異率僅為周圍序列的1/5[14-16]。本研究中,MyoD1基因在中華鱉群體中共檢測到6個SNP位點,其中T-49G和A-38G位點位于基因啟動子區(qū)域,C91T和A187T位點位于基因內(nèi)含子1,C880T位于基因外顯子2,T1522A位于基因外顯子2下游區(qū)域。雖然基因非編碼區(qū)的突變位點不參與氨基酸編碼,但會改變基因表達(dá)效率進(jìn)而影響機體的生命活動[17-19]。C880T位點僅存在CC和CT基因型,可能是實驗群體經(jīng)多代選育,人工選擇使部分等位基因頻率發(fā)生改變,需擴大樣本群體做進(jìn)一步研究。
生肌調(diào)節(jié)因子家族由MyoD、Myf5、MyoG和MrF44個成員組成,在肌肉生成、肌原纖維蛋白合成及肌纖維數(shù)量調(diào)節(jié)等方面起到重要作用,其中,MyoD基因在骨骼肌發(fā)育過程起關(guān)鍵的正向調(diào)控作用,促進(jìn)骨骼肌的形成和分化[20-21]。研究表明,MyoD基因突變體會引起斑馬魚胚胎期體節(jié)肌肉減少[22]。MyoD基因多態(tài)性與生長性能的關(guān)聯(lián)研究在水產(chǎn)動物中報道不多。于凌云等[23]在獲取大口黑鱸MyoD基因序列后篩選出7個與生長性狀相關(guān)聯(lián)的突變位點;陳松波等[24]在牙鲆MyoD基因內(nèi)含子1上發(fā)現(xiàn)2個SNP對體重、體長和體高等生長性狀影響顯著;Chen等[25]分析了MyoD1a基因和MyoD1b基因在虹鱒群體的多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)多個突變位點對肉質(zhì)性狀有顯著影響;陳靜等[26]在草魚MyoD基因內(nèi)含子1上發(fā)現(xiàn)SNP在體質(zhì)量、體寬、體高和眼間距等生長性狀存在顯著差異。
在本研究中MyoD1基因多態(tài)性位點與中華鱉生長性狀的相關(guān)分析結(jié)果表明,基因啟動子區(qū)域T-49G位點的不同基因型在背甲寬存在顯著差異(P<0.05),GG基因型顯著大于TT基因型;基因啟動子區(qū)域A-38G位點的不同基因型在背甲寬存在顯著差異(P<0.05),AG基因型顯著大于AA基因型;內(nèi)含子1 A187T位點的不同基因型在體高存在顯著差異(P<0.05),TT基因型均顯著大于AA基因型,體重、背甲長、背甲寬、腹甲長、腹甲寬、裙邊后側(cè)寬雖無顯著差異,但TT基因型也均大于AA和AT基因型。外顯子2下游區(qū)域T1522 A位點的不同基因型在體質(zhì)量存在顯著差異(P<0.05),AA基因型顯著大于TT和TA基因型。因此,MyoD1基因可作為研究中華鱉生長性狀的候選基因,下一步工作要增加關(guān)聯(lián)的樣本數(shù),著重分析T-49G、A-38G、A187T和T1522A位點的影響效用,進(jìn)一步篩選出中華鱉分子標(biāo)記輔助選育的有效標(biāo)記。
本研究在中華鱉MyoD1基因上鑒定出6個SNP位 點(T-49G、A-38G、C91T、A187T、C880T和T1522A),其中C880T位于外顯子上,屬于錯義突變。除A187T 位點外,其余5個位點的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg定律。分析各位點與中華鱉生長性狀之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),T-49G位點GG基因型個體的背甲寬顯著大于TT基因型,A-38G位點AG基因型個體的背甲寬顯著大于AA基因型,A187T位點TT基因型個體的體高顯著大于AA基因型,T1522A位點AA基因型個體的體質(zhì)量顯著大于TT、TA基因型,其余位點不同基因型個體間的生長性狀均不存在顯著差異。