張舒婷 陳賽賽

（沈陽化工大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，沈陽 110142）

耐藥菌感染被稱為“當(dāng)代最大的健康威脅之一”，特別是具有多重耐藥能力的超級細(xì)菌，如產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科細(xì)菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌、多重耐藥銅綠假單胞菌等［1-4］，2014 年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《抗菌素耐藥：全球監(jiān)測報告》顯示：每年美國和歐盟范圍內(nèi)因感染超級耐藥細(xì)菌而死亡的人數(shù)分別達到 6.3 和2.5萬人。

海洋環(huán)境尤其是近岸海域容易受到耐藥菌的污染，造成耐藥菌在海洋環(huán)境的流行［5-7］。有學(xué)者從海水浴場中分離出8株具有多重耐藥性的大腸桿菌［8］，這些耐藥菌對人體健康有較大威脅。國內(nèi)外學(xué)者對海水浴引起的疾病風(fēng)險進行系統(tǒng)評估的結(jié)果顯示，浴者比非浴者有更高的胃腸道感染的風(fēng)險，且漲潮和雨后會增加其風(fēng)險［9-10］，也有數(shù)據(jù)表明海水浴場中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌可能會引起海水浴者的尿路感染［11］，因此，海水浴已成為人類感染耐藥菌的潛在途徑。國內(nèi)大多數(shù)關(guān)于海水浴場耐藥菌的研究都是基于糞便污染指示菌，研究對象比較單一，且對細(xì)菌耐藥譜的研究不全面，本實驗對從海水浴場篩選到的所有MDRO進行了耐藥特征的分析，并對其進行種屬鑒定，為海水浴場耐藥細(xì)菌的污染狀況提供了更加詳細(xì)的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 R2A培養(yǎng)基與MH培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）；抗生素：氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、卡那霉素（北京索萊寶科技有限公司）；藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）；EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit、2×TransTaq High Fidelity PCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；引物合成及測序由美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.1.2 實驗主要儀器 TC型基因擴增儀-LifeECO型號（杭州博日科技有限公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；藍盾501S可見光凝膠投射儀（廈門致善生物科技股份有限公司）；德國SIGMA 1-16/16K小型臺式離心機（德國Sigma離心機有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 于2017年8月到青島海水浴場采樣，以浴者密度最大點、距浴者密度最大點兩側(cè)各50米處及距離海岸1公里處為海水采樣點，以浴場近岸的潮上帶、潮間帶、潮下帶的表面沙層5 cm以下為沙樣采樣點。各采樣點設(shè)3個平行樣，水樣用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，將濾膜與沙樣收集盒冷藏于采樣箱中。

1.2.2 細(xì)菌的分離與純化 在無菌條件下將剪碎的濾膜或沙樣置于一定的生理鹽水中，經(jīng)振蕩器充分震蕩，用生理鹽水將各個樣本稀釋為不同梯度濃度，分別涂布于R2A瓊脂培養(yǎng)基，29℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)形態(tài)、顏色、表面濕潤程度、邊緣形態(tài)等差異挑取單菌落純化培養(yǎng)。

1.2.3 MDRO的篩選 通過抗性篩選平板進行MDRO的篩選。將分離出的細(xì)菌在含有不同抗生素的R2A瓊脂培養(yǎng)基上分別進行劃線培養(yǎng)，篩選出能同時對三種及以上抗生素耐藥的細(xì)菌?？股丶捌浣K濃度分別為氨芐西林（100 mg/L）、氯霉素（30 mg/L）、鏈霉素（30 mg/L）、四環(huán)素（30 mg/L）、卡那霉素（30 mg/L）。

1.2.4 藥敏試驗 采用K-B藥敏紙片擴散法對篩選到的MDRO做藥敏試驗。用生理鹽水將培養(yǎng)18 h的菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基，并將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面。質(zhì)控菌株采用大腸埃希菌（ATCC 25922）。判讀標(biāo)準(zhǔn)參照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）［12］推薦的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 PCR擴增模板的制備 使用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒提取MDRO的基因組DNA，并用可見光凝膠透射儀觀察結(jié)果，作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.6 16S rDNA與耐藥基因的PCR擴增 PCR反應(yīng)體系為：2×TransTaq High Fidelity PCR SuperMix1為10 μL，去離子水6μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL。16S rDNA的PCR擴增采用通用引物（27F，1492R），反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1min、52℃退火1min、72℃延伸10 min，此3個程序進行35個循環(huán)；72℃終延伸10 min。耐藥基因的PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、退火30 s、72℃延伸5min，此3個程序進行30個循環(huán)；72℃終延伸5 min（退火溫度及引物見表3）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與MDRO的篩選

經(jīng)過對樣本細(xì)菌的分離培養(yǎng)，共得到271株可培養(yǎng)菌株，將其涂布于五種含不同抗生素的抗性篩選平板上，結(jié)果顯示271株可培養(yǎng)菌株對五種抗生素的耐藥率差異不大，其中對四環(huán)素耐藥率最低（16.6%），見表1。經(jīng)篩選，對3種及以上抗生素耐藥的MDRO有60株，MDRO的分離率為22.1%，其中有3株MDRO來自于距離岸邊1公里處的水樣中。

表1 271株細(xì)菌對5種抗生素的耐藥率

2.2 MDRO藥敏試驗

2.2.1 總體耐藥特征 藥敏試驗結(jié)果（表2）顯示，60株MDRO對九大類15種抗生素的耐藥率在31.6%-81.7%，除氟氧沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和氟苯尼考外，60株MDRO對其他11種抗生素的耐藥率均在50%以上，其中對鏈霉素（81.7%）、磷霉素（78.3%）、甲氧芐氨嘧啶（78.3%）的耐藥率較高，對氟苯尼考耐藥率最低（31.6%）。從抗生素種類分析，60株MDRO對氨基糖苷類、磺胺類和磷霉素類抗生素耐藥率較高，對喹諾酮類、四環(huán)素類和氟苯尼考類抗生素較敏感。

表2 60株多重耐藥菌對15種藥敏紙片的敏感度

2.2.2 MDRO的多重耐藥情況 藥敏試驗結(jié)果（圖1）顯示60株MDRO中至少對4種抗生素耐藥，有5株MDRO對15種抗生素全部耐藥，其中對10種以上抗生素耐藥的有35（58.3%）株。值得注意的是編號為H2B3、H2B17、H2C27、H6C3、H6C11的MDRO對15種藥敏紙片均表現(xiàn)為耐藥，且均為條件致病菌。

圖1 MDRO對15種抗生素的多重耐藥性

2.3 鏈霉素和四環(huán)素耐藥基因的攜帶情況

為探究MDRO的耐藥表型與耐藥基因間的相關(guān)性，選擇鏈霉素和四環(huán)素耐藥基因進行PCR檢測，引物見表3。結(jié)果顯示，60株 MDRO中有2株顯示strA-strB陽性，31株顯示aadA1陽性，33株鏈霉素耐藥基因陽性菌株中有97%的菌株表現(xiàn)為耐藥表型陽性；另外，有11株顯示tetA陽性，3株顯示tetB陽性，14株四環(huán)素耐藥基因陽性的菌株全部表現(xiàn)為四環(huán)素耐藥表型陽性。

2.4 耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性分析

為進一步驗證MDRO的耐藥表型與耐藥基因間的相關(guān)性，用SPSS 19.0軟件對其進行卡方檢驗，結(jié)果顯示，鏈霉素耐藥基因陽性菌株中的耐藥表型陽性菌株顯著高于耐藥基因陰性菌株，四環(huán)素耐藥基因陽性菌株中的耐藥表型陽性菌株顯著高于耐藥基因陰性菌株，表明細(xì)菌耐藥性與耐藥基因的檢出率呈正相關(guān)（表4，表5）。

2.5 16S rDNA序列的PCR檢測及種屬鑒定

提取60株MDRO的基因組DNA作為模板，PCR法擴增其16s rDNA基因片段并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果（圖2），將PCR產(chǎn)物送測序公司測序。通過Mothur軟件將測序所得的基因序列進行操作分類單元聚類分析，將相似性≥97%的序列歸為一個OTU，共分為33個OTU。選出每個OTU的代表序列，并通過NCBI網(wǎng)站進行比對，選出同源性最高的序列作為參考序列并下載。將33個代表序列及其參考序列用MEGA 5.0 軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），初步確定耐藥細(xì)菌所屬菌屬。

表3 耐藥基因檢測所用引物

表4 60株MDRO鏈霉素耐藥表型與鏈霉素耐藥基因的相關(guān)性分析

表5 60株MDRO四環(huán)素耐藥表型與四環(huán)素耐藥基因的相關(guān)性分析

圖2 部分細(xì)菌樣品16S rDNA基因片段電泳圖

結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹和比對結(jié)果進行初步鑒定，從青島海水浴場篩選出的60株MDRO屬于6個綱，24個菌屬，分別為α-變形菌綱的短波單胞菌屬（Brevundimonas）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、玫瑰單胞菌屬（Roseomonas）、甲基營養(yǎng)菌屬（Methylobacterium）；β-變形菌綱的戴爾福特菌屬（Delftia）；γ-變形菌綱的寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）；芽孢桿菌綱的葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）；放線菌綱的節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、土壤球菌屬（Agrococcus）、紅球菌屬（Rhodococcus）、微球菌屬（Micrococcus）、考克氏菌屬（Kocuria）、兩面神菌屬（Janibacter）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、原小單孢菌屬（Promicromonospora）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、白蟻菌屬（Isoptericola）、劉志恒菌屬（Zhihengliuella）；擬桿菌綱的擬桿菌屬（Pedobacter）。其中寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）占比最大（16%），其次分別為微桿菌屬（Microbacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）分別占比13%、8%、8%，其他菌屬數(shù)量較少。值得注意的是，對15種藥敏紙片均表現(xiàn)為耐藥的H2B3、H2B17、H2C27菌株經(jīng)初步鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌，H6C3、H6C11菌株為缺陷短波單胞菌，均為條件致病菌。

3 討論

圖3 33個OTU代表序列及其參考序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

海水浴場受人類活動影響較大，通常含有較多耐藥的致病菌，海水浴者通過皮膚接觸或海水吞咽等方式易感染耐藥致病菌，面臨一定的健康風(fēng)險［15］，因此對海水浴場耐藥菌的調(diào)查研究尤為重要。本實驗對青島海水浴場中MDRO分離率為22.1%，與De Oliveira等［16］的調(diào)查結(jié)果相比，要高于其在巴西東南部休閑海域MDRO分離率（6.9%-8.33%），揭示了青島海水浴場的耐藥菌污染較為嚴(yán)重。雖然耐藥菌的存在通常與人類活動有關(guān)，但本研究中有3株MDRO來自于浴者罕至的距離岸邊1公里處的水樣中，甚至有關(guān)研究在人類活動罕至的南極地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了具有多重耐藥性的細(xì)菌［17］，表明細(xì)菌的耐藥性可以從海岸擴散到更遠的海域。

抗生素的不合理使用是造成耐藥菌流行的主要原因，有關(guān)研究對我國多地海水養(yǎng)殖場的耐藥菌進行了調(diào)查，結(jié)果顯示海水養(yǎng)殖區(qū)的耐藥菌對氨基糖苷類和磺胺類抗生素表現(xiàn)出了高耐藥率［18］，對喹諾酮類、氟苯尼考類抗生素的耐藥率較低［19］，與本研究結(jié)果大致吻合，側(cè)面反映出海水浴場細(xì)菌的耐藥情況或與海水養(yǎng)殖中抗生素的使用有較大關(guān)系。本研究分離出的MDRO顯示出了對鏈霉素的高耐藥率，Andrade等［20］對圣維森特兩個海灘水樣及沙樣中的大腸桿菌的耐藥性進行了研究，也顯示出了對鏈霉素的高耐藥率，這可能與鏈霉素臨床應(yīng)用較早有關(guān)。另外，有數(shù)據(jù)顯示海水浴場細(xì)菌的耐藥性還與糞便污染程度和攜帶致病菌的浴者數(shù)量有關(guān)，人類糞便污染指數(shù)較高的海水浴場有更高的耐藥率［20-22］。

有研究表明細(xì)菌的耐藥表型與耐藥基因的檢出率相關(guān)［23］，本研究對60株MDRO的鏈霉素耐藥基因和四環(huán)素耐藥基因進行了PCR檢測，結(jié)果也顯示了細(xì)菌耐藥表型和耐藥基因檢出率的正相關(guān)性。60株MDRO分屬于24個菌屬，且多為條件致病菌，其中有3株對15種抗生素均耐藥的MDRO經(jīng)鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌，該菌主要引起呼吸道感染，是重要的醫(yī)院感染菌，其分離率在非發(fā)酵菌中，僅次于銅綠假單胞菌和鮑曼氏不動桿菌［24］；另外，還有2株對15種抗生素均耐藥的MDRO經(jīng)鑒定為缺陷短波單胞菌，該菌雖然致病率低，但致病作用較強，已有報道表明其可引起顱內(nèi)感染和腹膜炎［25-26］，這些細(xì)菌的致病率取決于各種因素，例如水中的污染程度、暴露的時間及海灘游客的免疫狀況，有研究顯示，浴者暴露于海水中15分鐘即可帶入6×106CFU的金黃色葡萄球菌［27］，因此海水浴場中的耐藥致病菌對浴者有較大的健康風(fēng)險。建議相關(guān)部門把浴場的耐藥菌污染情況作為浴場水質(zhì)監(jiān)測的項目之一，另外，由于海水中的耐藥菌主要來自于人類和動物糞便、城鎮(zhèn)污水的排放及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，對于靠近海濱度假勝地的沿海地區(qū)，應(yīng)加強對城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的監(jiān)督，從源頭控制耐藥菌的擴散。

4 結(jié)論

研究結(jié)果顯示，青島海水浴場的MDRO有較高的分離率（22.1%），對氨基糖苷類、磺胺類、磷霉素類抗生素耐藥性較強，并分離到有5株對15種抗生素均有耐藥性的MDRO，表明青島海水浴場的耐藥菌污染較嚴(yán)重。海水浴場的MDRO多樣性豐富，60株MDRO屬于6個綱，24個菌屬，且多為條件致病菌，其中寡養(yǎng)單胞菌屬占比最大（16%）。另外，研究表明MDRO對鏈霉素、四環(huán)素的耐藥表型與其耐藥基因的檢出率顯著相關(guān)。