朱莉莉，黃治國，衛(wèi)春會(huì)，鄧杰，謝軍

（四川理工學(xué)院，釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000）

中國白酒是以曲類、酒母為糖化發(fā)酵劑，利用淀粉質(zhì)（糖質(zhì)）原料，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、陳釀和勾兌而釀制而成，酒質(zhì)無色（或微黃）透明，氣味芳香純正，入口綿甜爽凈，酒精含量較高，經(jīng)貯存老熟后，具有以酯類為主體的復(fù)合香味[1-3]。作為發(fā)酵的動(dòng)力，糖化發(fā)酵劑的質(zhì)量直接關(guān)系到酒的質(zhì)量和產(chǎn)量。從20世紀(jì)80年代起，有關(guān)白酒微生物的研究進(jìn)入了高潮，從酒廠、科研機(jī)構(gòu)到學(xué)校都在做有關(guān)白酒微生物的研究，酒曲微生物功能的研究仍主要集中于產(chǎn)香微生物，常采用生化平皿和酯化酶活力的方法對(duì)產(chǎn)香微生物進(jìn)行篩選[4-6]，并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS）分析和產(chǎn)酶條件分析來準(zhǔn)確反映微生物的代謝機(jī)理及特性，主要包括酵母、霉菌和細(xì)菌等[7-8]。吳衍庸深入研究了酒曲微生物和中國白酒香型的關(guān)系，他認(rèn)為酒曲的質(zhì)量對(duì)其中微生物功能的發(fā)揮影響很大[9]；云敏等從醬香型酒曲中篩選的霉菌用于純種培養(yǎng)制曲，通過感觀和理化分析，初步得出紅曲霉菌株的代謝產(chǎn)物是醬酒風(fēng)味物質(zhì)主要來源[10]；陳曉春等研究了根霉酯化酶與酒香形成的關(guān)系，研究表明酯化酶制劑具有較高的酯化能力，通過提高白酒里乙酸乙酯、己酸乙酯等能夠形成酒香的主要成分的含量，明顯改善了白酒香型與品質(zhì)[11]；王邦坤等通過大量的試驗(yàn)證明，采用產(chǎn)香霉菌接種曲藥，可以明顯提高大曲的質(zhì)量[12]。本文對(duì)來源于酒曲中的霉菌進(jìn)行篩選，以獲得一株產(chǎn)香能力強(qiáng)的菌株，對(duì)其生長條件進(jìn)行優(yōu)化，為豐富釀酒微生物菌種資源庫、提高酒曲質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從大曲、小曲及麩曲等酒曲中篩選得到的25 株霉菌，由釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與配制

主要試劑：氫氧化鈉、硫酸、無水乙醇、酚酞、瓊脂、蔗糖、氫氧化鉀、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、碳酸鈉：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

試劑的配制：0.9%生理鹽水、乳酸-石碳酸-棉藍(lán)染液、1%酚酞指示劑、溴甲酚綠-甲基紅指示液等[6，13]。

培養(yǎng)基的制備：馬鈴薯固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar,PDA）、PDA 液體培養(yǎng)基、產(chǎn)酯化酶初篩培養(yǎng)基、產(chǎn)酯化酶復(fù)篩培養(yǎng)基[14-16]。

1.3 主要儀器設(shè)備

超凈操作臺(tái)（SW-CJ-2D）：蘇潔凈化設(shè)備有限公司；智能生化培養(yǎng)箱（LHR）：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-103D）：上海智城分析儀器制造有限公司；菌落分析儀（Scan1200）：Inter science公司；電子分析天平（BS224S）：塞多利斯科學(xué)儀器北京有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 霉菌的分離活化

將實(shí)驗(yàn)室保存的霉菌菌株接種到PDA 平板培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，進(jìn)行活化。將活化后的霉菌用平板劃線的方法分離出單菌落，挑取單菌落接種于PDA 斜面培養(yǎng)基，保存在4 ℃冰箱中備用。

1.4.2 產(chǎn)香霉菌的初篩

取活化后的霉菌接種到平板篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落周圍產(chǎn)生透明圈的情況，若產(chǎn)透明圈則表明霉菌具有產(chǎn)酯化酶能力，透明圈越大則產(chǎn)生的酯化酶水解能力越強(qiáng)[17-18]。

1.4.3 產(chǎn)香霉菌的復(fù)篩

以透明圈平均直徑（D，mm）與菌落平均直徑（d，mm）之比（D/d）＞1.5 為復(fù)篩條件選擇菌株制成菌懸液[19]，取2 mL 的菌懸液加入裝有100 mL 產(chǎn)酯化酶復(fù)篩培養(yǎng)基的 250 mL 錐形瓶中，于 32 ℃、150 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)液經(jīng)6 000 r/min 離心20 min 去沉淀，上清液即為酶液，置于4 ℃冰箱中留存?zhèn)溆肹17]；取己酸1.5 mL 于250 mL 錐形瓶中，加25 mL 無水乙醇，稍微振蕩后，加入75 mL 蒸餾水，充分混勻。再加入0.2 mL酶液加到錐形瓶中，搖勻后，用塞子塞上，密封，置于35 ℃恒溫箱內(nèi)保溫酯化24 h，同時(shí)做平行試驗(yàn)和空白試驗(yàn)，并采用皂化回流法測(cè)定總酯含量[20]。

1.4.4 菌株生長特性單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素水平設(shè)計(jì)表見表1。

表1 單因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 The design of single factors

以溫度、pH 值、耗氧量為因素設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，在試驗(yàn)過程中，當(dāng)單一因素變化時(shí)，其它因素都以有底紋的數(shù)據(jù)作為參數(shù)，研究單一因素變化對(duì)菌株生長質(zhì)的影響。試驗(yàn)通過菌絲體干重法進(jìn)行檢測(cè)，即將培養(yǎng)結(jié)束的菌液，裝入離心管中，用蒸餾水將錐形瓶洗滌3 次，將洗滌液一并倒入離心管中，在6 000 r/min 下，離心20 min，去除上清液，在105 ℃下烘干至恒重，并稱其干重[15]。

1.4.5 菌株生長特性正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)L9（34）因素水平表見表2。

表2 正交水平表Table 2 Level of orthogonal table

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交表對(duì)溫度，pH 值，耗氧量等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)各因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香霉菌的篩選

2.1.1 初篩

初篩結(jié)果見表3。

將實(shí)驗(yàn)室保存的25 株霉菌接種到產(chǎn)香篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)觀察，出現(xiàn)透明圈的菌株有M23、M31、M34、M35、M40、M43、M51、M57 共 8 株菌株，以 D/d＞1.5 為復(fù)篩條件，選擇 M23、M32、M35、M57 作為復(fù)篩出發(fā)菌株。

2.1.2 復(fù)篩

復(fù)篩結(jié)果見表4。

將初篩獲得的8 株霉菌接種到產(chǎn)酯培養(yǎng)基中，32 ℃發(fā)酵4 d 后，通過皂化回流法測(cè)得的各菌株相對(duì)應(yīng)的總酯的含量（以己酸乙酯計(jì)），從表4中可以看出，在相同的條件下，霉菌M23 產(chǎn)香能力最強(qiáng)，總酯含量達(dá)到1.765 g/L。篩選得到產(chǎn)香霉菌M23，后續(xù)將對(duì)其進(jìn)行鑒定及生長特性研究。

表3 初篩菌株D/d值比較Table 3 Early screening strains D/d value comparison mm

表4 總酯含量測(cè)定結(jié)果Table 4 The total esters content in fermenting liquid g/L

2.2 菌株鑒定

M23 菌體形態(tài)圖見圖1。通過培養(yǎng)觀察，經(jīng)1 d 后菌落初呈白色；2 d 后成灰白色，菌落較大，質(zhì)地疏松；3 d 后已長出大量孢子，呈黑色。將菌種在400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察個(gè)體形態(tài)，菌株菌絲無隔膜、有分枝和假根，營養(yǎng)菌絲體上產(chǎn)生匍匐枝，匍匐枝的節(jié)間形成特有的假根，從假根處向上叢生直立、不分枝的孢囊梗，頂端膨大形成圓形的孢子囊，囊內(nèi)產(chǎn)生孢囊孢子。通過形態(tài)觀察和結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》，初步鑒定M23為根霉屬。

圖1 M23菌體形態(tài)圖Fig.1 The morphology figure of M23

2.3 菌株生長特性

2.3.1 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖2。對(duì)M23 培養(yǎng)條件中的溫度、不同初始pH 值、耗氧量3個(gè)因素進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，M23 在24 ℃～36 ℃之間均可進(jìn)行不同程度的生長，在28 ℃～32 ℃之間在生長較好，最適生長溫度 30 ℃；當(dāng) pH 值高于 7.0 或低于 5.0 時(shí)，M23 菌絲生長明顯受到抑制，在pH 值為6.0 時(shí)生長最好；M23 在150 r/min 條件下菌絲量最大，轉(zhuǎn)速過低影響菌絲體分散，容易形成菌絲團(tuán)，不利于菌體對(duì)營養(yǎng)的吸收利用，轉(zhuǎn)速過高不利于菌體生長。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Single-factor test results

2.3.2 正交試驗(yàn)

2.3.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 5 Fermentation conditions L9（34）orthogonal experiment results

續(xù)表5 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果表Continue table 5 Fermentation conditions L9（34）orthogonal experiment results

表6 方差分析Table 6 Variance analysis of the orthogonal test

影響M23 生長的培養(yǎng)條件的主要順序?yàn)锽＞C＞A，即pH 值＞耗氧量＞培養(yǎng)溫度；最佳培養(yǎng)條件為A2B2C2，即培養(yǎng)溫度為30 ℃，初始pH 值為6.0，耗氧量為150 r/min；方差分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)溫度和耗氧量對(duì)M23 的生長具有顯著性影響，培養(yǎng)基初始pH 值對(duì)其生長具有極顯著性影響。

2.3.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，M23 的最佳培養(yǎng)條件為A2B2C2，即培養(yǎng)溫度為 30 ℃，初始 pH 值為 6.0，耗氧量為150 r/min，在此條件下培養(yǎng)所得的菌株的生長最好，與正交試驗(yàn)結(jié)果最好的為第4 組A2B1C2有一定差異，因此，以正交表中結(jié)果最好的第4 組A2B1C2號(hào)為對(duì)照組進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)表Table 7 Validation test table

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組培養(yǎng)條件結(jié)果相近，但方案A2B2C2菌絲干重略高于第4 組A2B1C2，所以M23 的最佳培養(yǎng)條件為A2B2C2，即培養(yǎng)溫度為30 ℃，初始pH 值為6.0，耗氧量為150 r/min。

3 結(jié)論與討論

本文以篩選于大曲、小曲及麩曲中的25 株霉菌為出發(fā)菌株，通過初篩和復(fù)篩得到了一株產(chǎn)香能力強(qiáng)的霉菌M23，總酯含量可達(dá)到1.765 g/L，初步鑒定為根霉屬。通過正交試驗(yàn)結(jié)果表明，M23 這株霉菌最佳生長條件為溫度30 ℃、培養(yǎng)基初始為pH 值為6.0、耗氧量為150 r/min。霉菌在整個(gè)食品加工工業(yè)中的用途愈加廣泛，許多釀造發(fā)酵食品、食品原料的制造，如豆腐乳、豆豉、醬、醬油、檸檬酸等都是在霉菌的參與下生產(chǎn)加工出來的。在中國白酒的釀造過程中同樣具有舉足輕重的作用，霉菌通過自身代謝作用將原料中的淀粉、糖類等碳水化合物、蛋白質(zhì)等含氮化合物及其它種類的化合物轉(zhuǎn)化成各種呈香呈味物質(zhì)或前體物質(zhì)，形成了中國白酒豐富的風(fēng)味體系，促成了中國白酒獨(dú)具一格的世界地位，在后續(xù)研究中將對(duì)霉菌M23 進(jìn)行深入研究并在實(shí)際生產(chǎn)中加以運(yùn)用。