陳佩，黨輝，郭紅軍，翟彩寧

（1.陜西廣播電視大學(xué)益生菌功能及應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 西安 710119；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides of lactic acid bacteria，LAB EPS）是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的一種糖類化合物，是乳酸菌在長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中適應(yīng)環(huán)境的產(chǎn)物，是無(wú)毒的有機(jī)體，對(duì)人體健康有益[1]。LAB EPS 不僅可以保護(hù)菌體而且因其具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗炎以及抗氧化等作用[2-4]，在諸如化妝品、制藥、食品等生物技術(shù)方面得以應(yīng)用。

生命體中源源不斷地產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括羥自由基，超氧陰離子自由基和過(guò)氧化氫等非自由基。它們?cè)隗w內(nèi)可產(chǎn)生一種負(fù)面作用，即氧化應(yīng)激[5]。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的各種組織和器官的功能逐漸下降，加速機(jī)體衰老和死亡，因此老化的速度可通過(guò)氧化損傷的衰減被延遲[6]。依據(jù)自由基老化理論，可以利用抗氧化劑中斷產(chǎn)生活性氧的反應(yīng)[7]，但是長(zhǎng)期使用抗氧化劑會(huì)給機(jī)體帶來(lái)一系列的副作用，如高血糖、高血壓和癌癥等。因此尋找開發(fā)更安全有效的天然抗氧化劑是非常必要的[8]。越來(lái)越多的報(bào)道表明乳酸菌的胞外多糖具有抗氧化活性，乳酸菌胞外多糖抗氧化研究正逐步興起。

研究所選用的菌株戊糖片球菌S44，是本實(shí)驗(yàn)室從陜南泡菜中篩選出的一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌[9]，研究主要評(píng)價(jià)了戊糖片球菌S44 胞外多糖的體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

戊糖片球菌S44：分離自陜南地區(qū)農(nóng)戶自制泡菜；人肝癌細(xì)胞系HepG2 細(xì)胞株：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基、雙抗（青、鏈霉素）、0.25%胰酶、胎牛血清、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸：美國(guó)Gibico 公司；乳酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基（De Man，Rogosa and Sharpe，MRS）：青島海博生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國(guó) sigma 公司；過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、1，10-鄰菲羅啉均為分析純：中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。

恒溫培養(yǎng)箱（DHP9012）：上海一恒科技有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher HERAcell150i cell）：美國(guó)Thermo 公司；超凈臺(tái)（SW-CJ-1CV）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；冷凍離心機(jī)（5415R）：德國(guó)Eppendorf 公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2100）：尤尼科上海有限公司；透析袋（MD16，截留分子量為8 000 D～14 000 D）：北京索萊寶科技有限公司；倒置顯微鏡（CX41-12C02）：日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 戊糖片球菌S44 的制備

將凍存于-80 ℃的戊糖片球菌S44 接入MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)活化3 代后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 胞外多糖的制備

將菌種接至200 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h 后將發(fā)酵液在 4 ℃，10 000×g 離心 20 min，棄沉淀；上清液中加入配制好的三氯乙酸（體積分?jǐn)?shù)為80%）至終濃度（三氯乙酸體積分?jǐn)?shù)）為4%，4℃下靜置過(guò)夜；再于 4 ℃，10 000×g 離心 20 min，棄沉淀。上清液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃濃縮至原體積的1/3，加入4 倍95%的乙醇于4 ℃靜置過(guò)夜，同上條件下離心20 min 后取沉淀溶于雙蒸水（double distilled water，ddH2O）中，并用ddH2O 透析3 d，每8 h 換水，收集透析液后真空冷凍干燥，得到戊糖片球菌胞外多糖。

1.2.3 總糖量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]的方法有所改動(dòng)。將冷凍干燥后的戊糖片球菌胞外多糖用ddH2O 溶解，利用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，并通過(guò)回歸方程計(jì)算戊糖片球菌的胞外多糖產(chǎn)量。

1.2.4 多糖溶液的制備

根據(jù)以上結(jié)果，配制1 mg/mL 的多糖母液，梯度稀釋，最終濃度為 0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 備用。

1.2.5 胞外多糖清除DPPH 自由基能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]的方法稍有修改。反應(yīng)體系中加入1 mL 樣品溶液，再加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH 的無(wú)水乙醇，震蕩充分混勻，室溫下（25 ℃）避光靜置反應(yīng)30 min，測(cè)定 517 nm 波長(zhǎng)處的樣品吸光度（OD 值）為A樣；用等體積的ddH2O 代替樣品溶液作為對(duì)照組A對(duì)，并以無(wú)水乙醇作為空白測(cè)定其吸光值為A空，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算DPPH 自由基清除率如下：

1.2.6 胞外多糖清除羥自由基能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]的方法稍有修改。1 mL 2.5 mmol/L 的1，10-鄰菲羅啉，1 mL pH 7.4 的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）和1 mL 水充分混勻后，再加入1 mL 2.5 mmol/L 的硫酸亞鐵，充分混勻后，加入1 mL 20 mmol/L 的過(guò)氧化氫，37 ℃中水浴1.5 h，在536 nm 處測(cè)定其OD 值為A空。把1 mL 水替換為1 mL 樣品液記為A樣，將1 mL 的過(guò)氧化氫替換為1 mL的水記為A對(duì)，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。按照如下公式計(jì)算多糖清除羥自由基的能力：

1.2.7 胞外多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

參照文獻(xiàn)[13]的方法稍有修改。分別加入濃度為0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的樣品溶液 1 mL，測(cè)定其在320 nm 處的吸光值，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。按照如下公式計(jì)算多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用：

式中：A樣為加入樣品和鄰苯三酚的吸光度；A對(duì)為加入樣品，但不加鄰苯三酚的吸光度；A空為不加樣品，但加入鄰苯三酚的吸光度。

1.2.8 胞外多糖還原能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]的方法稍有修改。0.5 mL 不同濃度的樣品中加入1 %鐵氰化鉀0.5 mL，0.5 mL PBS（pH 6.6），震蕩充分混勻，于50 ℃中水浴20 min，在冰浴中急速冷卻后，加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，3 000 r/min離心10 min，取其1 mL 上清后加入1 mL 0.1%的FeCl3，反應(yīng)10 min 后在700 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的OD 值，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。A700nm值越大，代表還原能力越強(qiáng)。

1.2.9 胞外多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞抗氧化能力的影響

細(xì)胞培養(yǎng)：將HepG2 細(xì)胞按常規(guī)方法復(fù)蘇后，置于含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺和1 %雙抗的低糖DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃，5 %CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)80%左右時(shí)，用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化細(xì)胞，按1∶3 傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

HepG2 細(xì)胞氧化損傷模型的建立：參照文獻(xiàn)[15]的方法有所改動(dòng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的HepG2 細(xì)胞按照2×105個(gè)/mL 接種到 96 孔板中，每孔 100 μL，37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入含過(guò)氧化氫終濃度分別為0.10 mmol/L 的DMEM 培養(yǎng)液，作用2 h，棄上清，以噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)細(xì)胞活力并以此建立氧化損傷模型。

胞外多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞抗氧化功能的影響測(cè)定：參照文獻(xiàn)[16]的方法有所改動(dòng)，用0.25%的胰蛋白酶消化收集生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于6 孔培養(yǎng)板，每孔2 mL培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2，培養(yǎng) 24 h 后，分組處理：空白對(duì)照組，加入2 mL DMEM 完全培養(yǎng)液；模型組，加入含過(guò)氧化氫的DMEM 培養(yǎng)液；樣品組，同時(shí)加入含過(guò)氧化氫的DMEM 培養(yǎng)液和不同濃度的胞外多糖樣品溶液。培養(yǎng)24 h 后，除去培養(yǎng)上清，每孔用PBS 洗滌3 次，然后每孔加1 mL 1%的Triton X-100，用吸管充分吹勻，2 000 r/min 離心15 min，收集上清即為細(xì)胞裂解液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

指標(biāo)測(cè)定：測(cè)定方法參照MDA、SOD 和T-AOC 測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0 進(jìn)行One－Way ANOVA，Tukey＇s 多重檢驗(yàn)（P＜0.05），數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖量測(cè)定

胞外多糖的含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品得到回歸為y=0.068 1x-0.002，R2=0.999 6，曲線擬合良好，戊糖片球菌S44 胞外多糖產(chǎn)量為（190.75±6.24）mg/L。

2.2 胞外多糖清除DPPH自由基的能力

DPPH 是一種人工合成的穩(wěn)定的自由基，其在517 nm 處具有較強(qiáng)的吸收峰，測(cè)定方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間較短。雖然DPPH 并不是人體實(shí)際能夠生成的一種自由基，但對(duì)DPPH 自由基的清除率在一定程度上仍然可以有效的評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化活性。因此測(cè)定DPPH 自由基的清除能力是測(cè)定抗氧化性的重要方法[17]。戊糖片球菌S44 胞外多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力見表1。

表1 胞外多糖清除DPPH自由基的能力Table 1 Scavenging activity of EPS against DPPH radical

表1結(jié)果表明戊糖片球菌S44 胞外多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，隨著胞外多糖濃度的增加，DPPH 自由基的清除率也逐漸增大。當(dāng)胞外多糖的濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，其DPPH 自由基的清除率比濃度為0.2 mg/mL時(shí)顯著增加了85.85 %（P＜0.05）。與同濃度的VC相比，胞外多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率均小于VC。楊晨璐等[3]研究表明植物乳桿菌的胞外多糖表現(xiàn)出較高的DPPH 自由基清除能力，清除率可達(dá)90%以上。張玲秀等[18]從家蠅體內(nèi)篩選出兩株高產(chǎn)胞外多糖的芽孢桿菌，其所產(chǎn)胞外多糖對(duì)DPPH 自由基具有顯著的清除作用，清除率達(dá)到20%以上。由此推斷，可能是菌株的特異性影響了其所產(chǎn)胞外多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力。

2.3 胞外多糖清除羥自由基的能力

羥自由基是活性氧自由基的一種，它具有最強(qiáng)的反應(yīng)活性，是僅次于氟的一種非選擇性氧化劑。能誘導(dǎo)核酸、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等生物大分子發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷。羥自由基清除劑的加入可以有效降低或緩解這些有害效應(yīng)，因此清除羥自由是抗氧化中很重要的一個(gè)指標(biāo)[19]。鄰二氮菲-Fe2+是一種氧化還原指示劑，F(xiàn)e2+與過(guò)氧化氫反應(yīng)后產(chǎn)生羥自由基，其具有很強(qiáng)的氧化能力。鄰二氮菲-Fe2+被羥自由基氧化后生成鄰二氮菲-Fe3+，導(dǎo)致其在536 nm 波長(zhǎng)處的最大吸收值減少。加入抗氧化劑之后，因羥自由基的濃度減少，所以體系中的吸光值隨之升高[20]。因此羥自由基的變化量可以根據(jù)加入樣品前后吸光值的大小變化來(lái)評(píng)價(jià)，以此來(lái)判定胞外多糖清除羥自由基的能力。戊糖片球菌S44 胞外多糖對(duì)羥自由基的清除能力見表2。

表2 胞外多糖清除羥自由基的能力Table 2 Scavenging activity of EPS against hydroxyl radical

隨著胞外多糖的濃度增加，對(duì)羥自由基的清除率呈上升趨勢(shì)，并且具有明顯的劑量依賴關(guān)系。同濃度胞外多糖對(duì)羥自由基的清除率均高于VC的清除率，當(dāng)樣品濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，胞外多糖對(duì)羥自由基的清除率可達(dá)80.14%。顏炳祥等[21]通過(guò)對(duì)乳酸乳球菌亞種的胞外多糖進(jìn)行硒化，顯著增強(qiáng)了胞外多糖對(duì)羥自由基的清除能力，使其對(duì)羥自由基的清除能力提高了34.99%，并且抑制羥自由基的能力與濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。故戊糖片球菌S44 胞外多糖在清除羥自由基方面也具有一定的提升空間。

2.4 胞外多糖清除超氧陰離子自由基的能力

超氧陰離子自由基是人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，加快機(jī)體的衰老過(guò)程，并可誘發(fā)一系列病變，嚴(yán)重危害人體健康。利用鄰苯三酚在堿性條件下能迅速氧化并釋放超氧陰離子自由基，生成有色中間產(chǎn)物的特性進(jìn)行超氧陰離子自由基清除的活性檢測(cè)。胞外多糖清除超氧陰離子自由基活性的結(jié)果如表3所示。

表3 胞外多糖清除超氧陰離子自由基的能力Table 3 Scavenging activity of EPS against superoxide anion free radical

從表3中可看出，隨著胞外多糖濃度的升高，其清除超氧陰離子自由基的能力也隨之增加，濃度與清除率呈正相關(guān)。與同濃度的VC相比，胞外多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率均小于VC。紀(jì)鵑[22]從新疆酸奶中篩選到一株瑞士乳桿菌，其所產(chǎn)胞外多糖對(duì)超氧自由基的清除活性與其濃度呈劑量依賴性，此結(jié)果與我們的研究結(jié)果一致。

2.5 胞外多糖的還原能力

還原力是測(cè)定抗氧化能力的另一個(gè)重要指標(biāo)，具有還原力的物質(zhì)是通過(guò)提供氫原子來(lái)中斷過(guò)氧化物的形成，破壞自由基反應(yīng)鏈，以防止氧化反應(yīng)[19]。還原能力是以普魯士藍(lán)的生成量為指標(biāo)，由赤血鹽（鐵氰化鉀）還原生成黃血鹽，再與Fe3+作用后生成普魯士藍(lán)，在700 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值大小判定還原能力。胞外多糖的還原能力見表4。

表4 胞外多糖的還原能力Table 4 The reducing ability of EPS

從表4中可看出，樣品的濃度與其還原能力有著劑量依賴關(guān)系，即還原力隨著濃度的提高而增強(qiáng)。當(dāng)濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，胞外多糖的還原能力比濃度為0.2 mg/mL 時(shí)提高了88.57%。與同濃度的VC相比，胞外多糖的還原能力均小于VC，濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，VC的還原力是胞外多糖的2.85 倍。

2.6 胞外多糖對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化功能的影響

T-AOC 是一個(gè)全面反映機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)，涵蓋了兩種作用體系的綜合結(jié)果，可以直觀地表征細(xì)胞抵御氧化損傷的能力。SOD 是一種重要的抗氧化酶，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，其活性高低可間接反映組織自由基的含量和細(xì)胞受損程度[23]。MDA 含量是細(xì)胞氧化損傷的一個(gè)重要檢測(cè)指標(biāo)，可通過(guò)測(cè)定MDA 的含量，了解機(jī)體內(nèi)膜脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。胞外多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞抗氧化活性的影響見表5。

表5 胞外多糖對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化活性的影響Table 5 The effects of EPS on antioxidant activities in HepG2 cells

續(xù)表5 胞外多糖對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化活性的影響Continue table 5 The effects of EPS on antioxidant activities in HepG2 cells

表5可看出，與對(duì)照組相比，模型組的T-AOC 和SOD 的活力分別顯著降低了57.70 %和20.83 %（P＜0.05），MDA 的含量顯著增加了 48.48%（P＜0.05），此結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化損傷明顯。與模型組相比，加入不同濃度的胞外多糖后，細(xì)胞中T-AOC 的活力顯著提高，且隨著濃度的增加，活力也隨之增大。當(dāng)胞外多糖濃度為0.3 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞中 T-AOC 的活力恢復(fù)至（4.33±0.06）U/mL，與對(duì)照組相比已無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。當(dāng)胞外多糖濃度為0.4 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞中SOD 的活力比模型組顯著升高30.92%（P＜0.05），并與對(duì)照組無(wú)顯著差異。與模型組相比，加入不同濃度的胞外多糖后，細(xì)胞中MDA 的含量顯著降低。當(dāng)胞外多糖濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞中MDA 的含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Zhang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌C88 的胞外多糖可以抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞中MDA 的形成，同時(shí)提高了SOD 和T-AOC 的活力，此與本研究結(jié)果一致。戊糖片球菌S44 胞外多糖能夠緩解HepG2 細(xì)胞的氧化損傷，推測(cè)其可能是胞外多糖增強(qiáng)了細(xì)胞中酶和非酶系統(tǒng)的抗氧化活性，減少了脂質(zhì)過(guò)氧化。

3 結(jié)論

對(duì)戊糖片球菌S44 的胞外多糖在體外的抗氧化能力進(jìn)行了研究，測(cè)定了其胞外多糖對(duì)DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，及其還原能力的大小。同時(shí)，評(píng)價(jià)了胞外多糖對(duì)由過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞的氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，胞外多糖對(duì)DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基均有較好的清除能力，對(duì)羥自由基的清除率可達(dá)80%以上。并且，胞外多糖能夠緩解由過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞的氧化損傷，提高了細(xì)胞中SOD 和TAOC 的活力，抑制了MDA 的形成。因此，戊糖片球菌S44 可作為潛在的抗氧化性能的食品添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn)中。