郭曉強，曹敏，梁立，陳芳，姚倩，*

（1.成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2.成都大學藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室，四川 成都 610106）

油橄欖葉富含橄欖苦苷、木犀草苷、咖啡酸、芹菜苷、槲皮素和蘆丁等多種酚類化合物[1]，具有廣泛的生物活性。低濃度的油橄欖葉提取物可抗各種細菌感染，在治療呼吸道及消化道感染上有潛在應用[2]；預先口服40 mg/kg 的油橄欖葉提取物，可以完全阻止乙醇引起的胃黏膜損傷，此作用與油橄欖葉多酚降低炎癥反應、提高機體的抗氧化能力相關[1]；常食橄欖多酚可以幫助調整血壓和血糖，減少低密度脂蛋白的氧化[3]。油橄欖葉多酚提取物還能保護大腦神經，減少大鼠腦梗死面積和腦水腫，對短暫性腦缺血后海馬神經元的損傷具有神經保護作用[4]。

油橄欖葉常用的提取方法包括超聲提取[5]、低壓沸騰提取[6]和微波提取[7]，由于超聲提取操作簡便、效率高、能耗低，成為實驗室使用最為廣泛的提取技術。常用的提取溶劑為不同濃度的乙醇和甲醇溶液[8-9]。水是廉價易得、綠色環(huán)保的溶劑，但較少被應用于植物提取，可能的原因為水提物成分復雜，后期純化較為困難。該試驗以總多酚為指標，采用響應面法優(yōu)化了油橄欖葉水提工藝，水提物經濃縮、醇沉處理后冷凍干燥為粉末，不吸濕，分散性好，易進一步加工為片劑或膠囊劑等固體制劑。本研究比較了油橄欖葉水提物、乙醇提取物及甲醇提取物的有效成分及體外抗氧化活性，為油橄欖葉水提工藝的應用及后續(xù)產品開發(fā)提供理論指導。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ-400KDE 型超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000A 型旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SCIENTZ 型冷凍干燥機：寧波新芝生物科技有限公司；7200 型可見-紫外分光光度儀：上海天普科技有限公司；Agilent 1100 高效液相色譜儀、Agilent 1100 紫外檢測器：美國Agilent Technologies 公司。

1.2 材料

油橄欖葉：由四川天源油橄欖有限公司提供，經粉碎后過80 目篩，-20 ℃貯藏備用，臨用前25 ℃下放置2 h；蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，純度大于98%；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）：日本 TCI 公司；2，2′-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate，ABTS]：南京奧多福尼生物科技有限公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）用乙腈和甲醇（色譜純）及其它試劑（分析純）：成都科龍化學試劑公司。

2 方法

2.1 油橄欖葉多酚的提取

2.1.1 水提取

取10 g 油橄欖葉，加200 mL 蒸餾水，0.125 g 硼砂，0.2 g NaHSO3，設置超聲儀溫度為60 ℃，超聲提取60 min。提取結束后，過濾，濾液減壓濃縮至60 mL，加入無水乙醇60 mL，4 ℃冷藏過夜。取上清液濾過，濾液經減壓濃縮除去90%的溶劑，余下的浸膏冷凍干燥24 h，再置真空干燥箱中干燥至恒重，以干重除以投料量計算提取率。提取物密封后4 ℃低溫保存。

2.1.2 乙醇溶液提取

取10 g 油橄欖葉，加入200 mL 濃度為44%的乙醇溶液（體積分數），在34 ℃下超聲提取60 min[8]。提取結束后，濾過，取濾液減壓濃縮除去溶劑，冷凍干燥24 h，步驟同水提取法。

2.1.3 甲醇溶液提取

取10 g 油橄欖葉，加入50 mL 濃度為80%的甲醇溶液（體積分數），25 ℃下超聲提取15 min[9]。其余步驟同水提取法。

2.2 含量測定

2.2.1 總多酚

取沒食子酸對照品，用甲醇制成濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL 的溶液，分別量取 0.5 mL，置 10 mL刻度試管中，加經10 倍稀釋的Folin 酚試劑2.5 mL[10]，混勻，25 ℃放置 5min；再加入 7.5%Na2CO3溶液 2.5 mL，混勻，30 ℃下反應 1 h，冷至 25 ℃，于 760 nm 波長處測定吸光度A，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。另取3 組油橄欖葉提取物，分別制成濃度為1 mg/mL 的溶液，分別量取0.5 mL，按沒食子酸對照品測定方法操作，記錄吸光度值A，由標準曲線計算提取物中總多酚含量。

2.2.2 總黃酮

取3 組油橄欖葉提取物，分別用對應的提取溶劑制成濃度為2 mg/mL 的溶液。分別精密量取3 mL，置25 mL 量瓶中，加 5 %NaNO2溶液 1 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10 %Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加4%的NaOH 溶液5 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，25 ℃下放置 15 min 后，于 506 nm 波長處測定吸光度A；另配制不加試劑的提取物空白溶液，測定吸光度，作為背景吸收值。取濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2 、0.4 mg/mL 及 0.8 mg/mL 的蘆丁對照品溶液，同法操作，繪制標準曲線，按外標法計算總黃酮含量。

2.2.3 羥基酪醇

HPLC 檢測的色譜條件為：固定相為迪馬C18 Diamonsil Plus 柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.2 %磷酸（2∶98，體積比），流速 1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長 235 nm。

測定方法為：油橄欖葉水提物用蒸餾水溶解并制成濃度為5 mg/mL 的溶液；乙醇和甲醇提取物樣品的制備方法為：分別取提取物0.1 g，置10 mL 量瓶中，加蒸餾水7 mL～8 mL，超聲5 min，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻；在8 000 r/min 下離心10 min，取上清液，作為供試品溶液。取羥基酪醇對照品，用水稀釋制成濃度分別為 0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 μg/mL 的溶液，作為對照品溶液。精密量取供試品溶液及對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積A，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，按外標法計算含量。

2.2.4 橄欖苦苷

HPLC 檢測的色譜條件為：固定相為迪馬C18 Diamonsil Plus 柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（22∶78），流速 1 mL/min，柱溫 35 ℃，檢測波長226 nm。

測定方法為：用水制備濃度為10 mg/mL 的提取物供試品溶液，制備方法同“2.2.3”項；取橄欖苦苷對照品，用水稀釋制成濃度為 0.5、1、2、4、8 μg/mL 的溶液，作為對照品溶液。精密量取供試品溶液及對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積A，繪制標準曲線，按外標法計算含量。

2.3 抗氧化活性檢測

2.3.1 DPPH 自由基清除率

取DPPH 固體，加乙醇溶解并制成濃度約為50 μg/mL 的溶液。取3 組油橄欖葉提取物，分別用對應的提取溶劑溶解并制成濃度為 15、30、60、120、240 μg/mL 的溶液。分別精密量取DPPH 溶液和提取物樣品溶液各2 mL，按文獻報道方法檢測[11]。

2.3.2 ABTS+自由基清除率

取3 組油橄欖葉提取物，分別用對應的提取溶劑溶解并制成濃度為 31.25、62.5、125、250、500 μg/mL 的溶液。分別精密量取提取物溶液及ABTS 溶液各2 mL，混勻，按文獻報道方法測定[12]。

2.3.3 羥基自由基清除率

取3 組油橄欖葉提取物，分別用對應的提取溶劑溶解并制成濃度為 0.25、0.5、1、2、4 mg/mL 的溶液。按文獻報道方法測定[11]。

2.3.4 還原力

取3 組油橄欖葉提取物，分別用對應的提取溶劑溶解并制成濃度為 0.25、0.5、1、2、4 mg/mL 的溶液。取系列濃度的提取物溶液1.0 mL，依次加入0.2 mol/L pH6.6 的磷酸鹽緩沖液及 1%K3Fe（CN）6溶液各 2.5 mL，混勻，于50 ℃下保溫20 min，冷至25 ℃，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，從中取2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL，0.1%FeCl3溶液 0.5mL，混勻，25 ℃放置 10 min，加冰醋酸1.5 mL 使溶解，于700 nm 波長處測定吸光度值；另取各提取物溶液1.0 mL，依次加入磷酸鹽緩沖液、蒸餾水及三氯乙酸溶液各2.5 mL，混勻，從中取出2.5 mL，加入蒸餾水3.0 mL，冰醋酸1.5 mL，混勻，測定吸光度值，作為背景值；以測得值減去背景值，得到各提取物的還原力吸光度值。

2.3.5 主成分分析

采用SPSS19.0 軟件對提取物總多酚、總黃酮等4個含量測定結果及4個抗氧化活性結果進行數據標準化處理，隨后采用降維因子分析對8個變量進行主成分分析，找到最能代表提取物的特征值，根據各特征值的方差貢獻，計算3 種提取方法的主成分綜合得分。

3 結果與分析

3.1 總多酚、總黃酮、羥基酪醇及橄欖苦苷含量

橄欖苦苷是油橄欖葉最重要的活性成分，在提取過程中易降解為羥基酪醇，降解物的抗氧化作用優(yōu)于橄欖苦苷，因此同時對這2個組分進行考察。在檢測羥基酪醇時，由于2 種醇提物含量均較低，故配制濃度較水提物提高1 倍；原選擇提取溶劑，即44%乙醇和80%甲醇分別溶解醇提物，但因制備濃度高，導致雜峰多，干擾大，羥基酪醇與其他組分的分離度很差?？紤]到0.1 g 提取物羥基酪醇含量極微，故將制備供試品用溶劑改為水，不僅保證了低濃度羥基酪醇的提出，同時除去了醇溶性雜質的干擾，羥基酪醇分離度明顯改善，檢測的準確度提高。橄欖苦苷水溶性好，因此使用水制備樣品溶液，減少水不溶性雜質的影響。

水提物、乙醇提取物及甲醇提取物的提取率分別為14.0%、10.4%及11.3%?？偠喾樱ㄒ詻]食子酸計）標準曲線為 A=5.83C+0.037（r=0.999 6），總黃酮（以蘆丁計）標準曲線為 A=1.868 2C+0.005（r=0.999 8），羥基酪醇標準曲線為A=11.83C+1.152（r=1.000 0），橄欖苦苷標準曲線為A=3.23C-0.10（r=0.999 1），各提取物含量測定結果見表1。

橄欖苦苷僅在甲醇提取物中檢測到，可能由于乙醇提取所用溶劑含大量水，水提法則完全以水為溶劑，超聲過程引起了橄欖苦苷水解。

表1 提取物含量測定結果（n=3）Table 1 Contents of the extracts（n=3）

3.2 抗氧化活性

3.2.1 DPPH 自由基清除率

DPPH 自由基清除率測定結果見圖1。

圖1 油橄欖葉不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除率Fig.1 The scanvenging rates of olive leaf extracts obtained by different solvents against DPPH free radicals

由圖1可知，3 種提取物對DPPH·的清除率均表現出了濃度依賴的趨勢，對DPPH·清除力的順序為：水提物＞甲醇提取物＞乙醇提取物。

3.2.2 ABTS+自由基清除率

油橄欖葉不同溶劑提取物對ABTS+自由基的清除率結果見圖2。

圖2 油橄欖葉不同溶劑提取物對ABTS+自由基的清除率Fig.2 The scanvenging rates of olive leaf extracts obtained by different solvents against ABTS+free radicals

由圖2可見，油橄欖葉水提物清除ABTS+自由基的能力明顯高于2 種醇提物，乙醇提取物的清除能力略強于甲醇提取物。

3.2.3 羥基自由基清除率

油橄欖葉不同溶劑提取物對羥基自由基的清除率測定結果見圖3。

圖3 油橄欖葉不同溶劑提取物對羥基自由基的清除率Fig.3 The scanvenging rates of olive leaf extracts obtained by different solvents against hydroxyl free radicals

由圖3可見，2 種醇提物對羥基自由基的清除能力優(yōu)于水提物。

3.2.4 還原力

油橄欖葉不同溶劑提取物的還原力測定結果見圖4。

圖4 油橄欖葉不同溶劑提取物的還原力Fig.4 The reducing power of olive leaf extracts obtained by different solvents

以80%甲醇為溶劑，油橄欖葉甲醇提取物的最大可配制濃度為2 mg/mL，超過此濃度即產生沉淀，因此甲醇提取物的還原力和羥基自由基清除率僅考察至2 mg/mL，水提物和乙醇提取物檢測至4 mg/mL。由圖可知，三者的還原力順序為：水提物＞甲醇提取物＞乙醇提取物。

3.3 主成分分析

3.3.1 相關矩陣

由SPSS19.0 軟件獲得的相關矩陣見表2。

表2 相關矩陣表Table 2 Correlation matrix table

由表2可知，總多酚、總黃酮及羥基酪醇與提取物各抗氧化活性指標相關性較大，相關系數接近1.0，橄欖苦苷僅與DPPH·清除率和ABTS+·清除率有相對較弱的負相關，而與羥基自由基清除率和還原力關聯度較小。

3.3.2 降維因子分析

成分含量與抗氧化指標對總方差的貢獻結果見表3。

表3 提取物含量與抗氧化活性指標對總方差的貢獻Table 3 The contribution of the extract content and antioxidant activity to total variance

由表3可知，總多酚對方差的貢獻率高達84.04%，總多酚與總黃酮對方差的總貢獻率達100%，說明描述提取物的特征值主要為總多酚和總黃酮，可將8個特征值降維為2個。

3.3.3 成分載荷圖

主成分載荷圖見圖5。

圖5 主成分載荷圖Fig.5 Loading map of principle components

由圖5可知，羥基酪醇、總黃酮及羥基自由基清除率對第一主成分總多酚有較大的正影響，三者取值高時則總多酚含量高，ABTS+·和DPPH·清除率對總多酚有較大的負影響，清除率高，消耗的多酚多，引起總多酚值下降。此外，橄欖苦苷和還原力對總多酚有中等程度的負影響，載荷系數在0.65～0.80 之間，這可能因為橄欖苦苷可降解為羥基酪醇多酚，當橄欖苦苷含量高時，則羥基酪醇含量低，導致總多酚值較低；還原力升高，消耗的多酚增加，也會引起總多酚值下降。橄欖苦苷和還原力對第二主成分總黃酮有中等程度的正影響，載荷系數在0.55～0.80 之間。

3.3.4 主成分得分

根據軟件計算的因子值，按下式計算各提取物主成分總得分：

主成分總分=2.585×FAC1×84.044+1.148×FAC2×15.956

式中：2.585 和 1.148 分別為主成分 1 和 2 特征值的算術平方根，FAC1 及FAC2 分別為軟件計算的主成分 1 和 2 因子值，84.044 及 15.956 分別為主成分 1 和2 的方差貢獻率，由此，得到水提物、乙醇提取物和甲醇提取物主成分總分分別為249.87、-136.89 及-112.98。說明水提物綜合評分明顯優(yōu)于二種醇提物，甲醇提取物略高于乙醇提取物。

油橄欖葉水提物主成分分析綜合評分結果遠高于二種醇提物，這可能源于水提過程中加入了硼砂保護酚羥基，并使用NaHSO3防止酚羥基氧化，隨后提取物經減壓濃縮，加入等體積乙醇沉淀醇不溶性雜質，在冷藏過程中，硼砂和NaHSO3析出，經濾過除去。保護劑的應用使得水提物含有高濃度的多酚和羥基酪醇；保護劑在醇溶液中溶解度差，限制了其在醇提技術中的使用。

4 結論

采用超聲法，分別以水、44%乙醇及80%甲醇為溶劑提取油橄欖葉，水提物總多酚與羥基酪醇含量、對ABTS+自由基的清除率及還原力顯著高于醇提物（p ＜0.01），但清除羥基自由基的能力不及醇提物。主成分降維因子分析結果顯示，總多酚和總黃酮為代表提取物的主要特征值，水提物、乙醇提取物和甲醇提取物的主成分得分分別為249.87、-136.89 及-112.98，表明水提物有效成分含量和抗氧化活性的綜合評分遠高于二種醇提物，具有巨大的應用潛力。