張慶芳，王澤坤，姜 南，于 爽，遲乃玉*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

纖維素（cellulose）約占整個植物干質(zhì)量的50%，是植物細胞壁的主要成分[1-3]。纖維素作為一種可再生資源，在實際生產(chǎn)中利用率并不高。目前，纖維素的降解方法主要有物理法、化學(xué)法和生物酶法。其中傳統(tǒng)的物理方法利用效率低，工藝條件難以控制；化學(xué)方法容易產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，污染環(huán)境且成本高；近年來，隨著生物酶解技術(shù)的發(fā)展和成熟，生物酶解已成為研究者的研究熱點[4-5]，而生物酶法綠色環(huán)保，反應(yīng)條件溫和，不產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)，且效率高[6-8]。因此，選擇高產(chǎn)纖維素酶菌株以增加纖維素的利用率具有十分重要的意義[5]。

反芻動物瘤胃液中的微生物能夠分泌纖維素酶并降解纖維素[9-10]，國外關(guān)于瘤胃細菌的研究較多，而我國對這方面的研究相對較少。LEE S M等[11]研究發(fā)現(xiàn)，稻秸青貯時添加純培養(yǎng)瘤胃真菌能夠降低青貯飼料中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，提高青貯飼料粗纖維的降解率；朱雅新等[12]成功構(gòu)建了荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因組BAC文庫，并從BAC文庫中篩選出16個具有淀粉酶活性和26個具有纖維素酶活性的陽性克??；李昊[13]從奶牛瘤胃液中分離到21株兼性纖維素分解細菌。

西藏黃牛耐寒、耐低氧能力突出，且瘤胃中的微生物產(chǎn)纖維素酶的能力高[14-15]。因此，本研究從西藏黃牛瘤胃中篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)技術(shù)對其進行鑒定，并對其所產(chǎn)的纖維素酶酶學(xué)特性進行研究，以期為纖維素酶制劑研制及益生菌制劑提供基礎(chǔ)，從而促進西藏地區(qū)農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

雌性黃牛：西藏娟姍純種繁育示范基地，年齡為4.5歲。

1.1.2 試劑

羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏、MgSO4·7H2O、瓊脂粉、氯化鈉、KH2PO4、（NH4）2SO4、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、剛果紅（均為分析純）：生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，CMC-Na 10 g/L，KH2PO42 g/L，（NH4）2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 5 mg/L，NaCl 3 g/L，pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 20g/L，（NH4）2SO42g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 5 mg/L，NaCl 3 g/L，瓊脂 15 g/L，pH7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2g/L，酵母膏1g/L，CMC-Na20g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，（NH4）2SO42 g/L，MnSO4·H2O 5 mg/L，NaCl 3 g/L，pH自然。

以上培養(yǎng)基均在0.1 MPa、121℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

CRY-2112立式恒溫搖床：上海茸研儀器有限公司；LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱：上海愛朗儀器有限公司；YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CR21N高速冷凍離心機：株式會社日立制作所；Multiskan GO全波長酶標儀；美國賽默飛世爾科技公司；BioLogMicro Station III全自動微生物鑒定儀：美國Bio Log有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃牛瘤胃液樣品的采集

使用聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）管在牛瘤胃的瘤胃囊中的不同位置提取牛瘤胃液樣品。收集后立即將樣品置于含有CO2的培養(yǎng)箱中，快速關(guān)閉。

1.3.2 富集培養(yǎng)

取1 mL西藏黃牛瘤胃液樣品于9 mL液體富集培養(yǎng)基中，150 r/min、37℃條件下培養(yǎng)4 d。

1.3.3 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選

初篩：富集培養(yǎng)液經(jīng)梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）稀釋后，取150 μL梯度稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，每個梯度設(shè)置三組平行，37℃條件下倒置培養(yǎng)4 d。每個梯度選擇一個平板用剛果紅溶液染色20 min，染色后，棄掉剛果紅染液并用1 mol/L NaCl脫色。如果在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，則可以初步證明該菌株是產(chǎn)纖維素酶的菌株。挑取產(chǎn)生透明圈的單菌落進行分離、純化。

復(fù)篩：基于初級篩選菌株的透明圈大小，選取透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值（D/d值）最大的菌株進行纖維素酶活力的測定。

1.3.4 纖維素酶活的測定方法[16]

葡萄糖標準曲線的繪制：取7支試管，分別加入質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL葡萄糖標準溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，加蒸餾水至2.0mL，分別加入2.0 mL DNS后在沸水浴中加熱2 min，迅速冷卻，并加入蒸餾水至15 mL?；旌虾?，使用分光光度計在波長540 nm處測定吸光度值（OD540nm值），以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。葡萄糖標準曲線為y=3.291 8x+0.032 5，R2為0.995 3，線性關(guān)系良好，可用于纖維素酶活力的測定。。

粗酶液的制備：將篩選菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為125 mL/250 mL，在37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)2 d，作為種子培養(yǎng)液。按1%（V/V）的接種量將種子培養(yǎng)液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為125 mL/250 mL，在37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)3 d，每24 h取出一定量的發(fā)酵液，室溫條件下4 000 r/min離心10 min，收集上清作為粗酶液。

纖維素酶活力的測定：取A和B兩只試管，分別加入1.8 mL 1%CMC-Na，A管中添加0.2 mL粗酶液，將A和B管于50℃恒溫水浴60 min，取出，分別加入2 mL DNS，B管中加入0.2 mL粗酶液，沸水浴10 min，快速冷卻，加入蒸餾水補充至15 mL。采用分光光度計測定OD540nm值。

1.3.5 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：采用平板點樣法獲得單菌落，通過革蘭氏染色的方法對菌體染色，鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

生理生化試驗：通過Biolog微生物鑒定系統(tǒng)進行生理生化試驗。

分子生物學(xué)鑒定：將復(fù)篩得到的高產(chǎn)纖維素酶菌株送交寶生物工程（大連）有限公司，對其16S rDNA進行測序，測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（nationalcenter forbiotechnologyinformation，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，利用MEGA5軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究

溫度對纖維素酶酶促反應(yīng)的影響：粗酶液分別于10～100℃（梯度為5℃）、pH 7.0條件下進行酶促反應(yīng)，測定不同反應(yīng)溫度下的纖維素酶活性，并以最大酶活力為100%，計算相對酶活。每個樣品重復(fù)測定3次。

熱穩(wěn)定性：將反應(yīng)體系分別在10～100℃（梯度為5℃）條件下保溫2 h，快速冷卻后，在37℃、pH 7.0條件下測定酶活力，并計算相對酶活。每個樣品重復(fù)測定3次。

pH對纖維素酶酶促反應(yīng)的影響：粗酶液分別在pH為3.0～10.0（梯度為0.5）、37℃條件下進行酶促反應(yīng)，測定不同反應(yīng)pH條件下的纖維素酶活性，并以最大酶活力為100%，計算相對酶活。每個樣品重復(fù)測定3次。

pH穩(wěn)定性：粗酶液在pH為3～10（梯度為0.5）、37℃條件下放置2 h，在37℃、pH 7.0條件下測定酶活力，并計算相對酶活。每個樣品重復(fù)測定3次。

金屬離子對纖維素酶活力的影響：反應(yīng)體系中添加0.5 mmol/L不同種類的金屬離子（K+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ag2+、Co2+）后，在37 ℃、pH 7.0條件下測定酶活力，并計算相對酶活。每個樣品重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

表1 篩選菌株透明圈直徑與菌落直徑比值Table 1 Ratio of transparent circle diameter and colony diameter of screened strains

圖1 菌株N30的產(chǎn)酶曲線Fig.1 Enzyme production curve of strain N30

通過初篩共篩選到7株產(chǎn)生透明圈的菌株，編號為N5、N7、N14、N18、N30、N36、N37，7株菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值（D/d值）見表1。由表1可知，菌株N30的透明圈直徑與菌落直徑比值最大，為7。因此，選取菌株N30為目的菌株，對其纖維素酶活力進行測定，菌株N30的發(fā)酵產(chǎn)酶曲線如圖1所示。由圖1可知，菌株N30在發(fā)酵72 h時，纖維素酶活力最大，為15.6 U/mL，其他從西藏地區(qū)動物胃腸道中篩選得到的產(chǎn)纖維素酶菌株的酶活力大多在10 U/mL以內(nèi)，該纖維素酶酶活與其他纖維素酶相比，酶活較高[17-18]。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株N30的菌落和細胞形態(tài)見圖2。由圖2a可知，菌落形態(tài)為淡黃色，半透明，光滑濕潤，邊緣整齊；由圖2b可知，菌株N30呈棒狀桿菌，染色后為紫色，屬于革蘭氏陽性菌。

圖2 菌株N30的菌落形態(tài)（a）和細胞形態(tài)（b）Fig.2 Colony morphology(a)and cell morphology(b)of strain N30

2.2.2 生理生化試驗

通過Biolog微生物鑒定系統(tǒng)共測定了菌株N30的103項生理生化特征，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株N30的淀粉水解、檸檬酸鹽和硝酸鹽還原試驗均為為陽性；可以利用48種碳源，如D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖等；易被氨曲南、溴酸鈉、醋竹桃霉素、林肯霉素、萬古霉素、萘啶酮酸等15種物質(zhì)抑制生長。結(jié)果表明，菌株N13的生理生化特征與模式株類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）基本一致，因此，初步鑒定菌株N30為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。

表2 菌株N30的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain N30

續(xù)表

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

利用軟件MEGA5中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，菌株N30與燦爛類芽孢桿菌（Paenibacillus lautus）N3-6聚于一支，同源性為99%。因此，結(jié)合菌株N30形態(tài)特征和生理生化特征，將其鑒定為燦爛類芽孢桿菌（Paenibacillus lautus）。

圖3 基于16S rDNA序列菌株N30的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain N30 based on 16S rDNA sequences

2.3 酶學(xué)特性

2.3.1 反應(yīng)溫度對纖維素酶酶促反應(yīng)的影響

由圖4可知，該纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，且在40～65℃保持較高的酶活，相對酶活＞80%；當(dāng)溫度超過65℃時，纖維素酶活力急劇下降；當(dāng)溫度為100℃時，相對酶活僅為9%。其他纖維素酶在25～45℃時保持50%以上酶活力，本研究中的纖維素酶相較于其他纖維素酶。最適溫度較高，應(yīng)用潛力更大[19]。

圖4 反應(yīng)溫度對纖維素酶活力的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on cellulase activity

2.3.2 纖維素酶的熱穩(wěn)定性

粗酶液的熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果見圖5。

圖5 纖維素酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of cellulase

由圖5可知，該酶在10～35℃之間保持較高的酶活力，相對酶活＞80%。當(dāng)處理溫度高于70℃后，相對酶活明顯下降；在70～90℃時，相對酶活仍在10%以上；在95℃保溫2 h后，纖維素酶失去活力。相較于其他纖維素酶（在45～55℃之間，相對酶活＞80%），該酶溫度穩(wěn)定性相對較高[20]。

2.3.3 反應(yīng)pH對纖維素酶酶促反應(yīng)的影響

反應(yīng)pH對纖維素酶酶促反應(yīng)的影響結(jié)果見圖6。

圖6 反應(yīng)pH值對纖維素酶活力的影響Fig.6 Effect of reaction pH value on cellulase activity

由圖6可知，該酶最適反應(yīng)pH值為4.5，同時該酶在pH 4.0～6.5時酶活較高；該酶在pH 7.0～9.0時仍保持60%的相對酶活，相較于其他纖維素酶最適pH無明顯差別[21]。

2.3.4 纖維素酶的pH穩(wěn)定性

菌株N30所產(chǎn)的纖維素酶的pH穩(wěn)定性結(jié)果見圖7。

圖7 纖維素酶的pH穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of cellulase

由圖7可知，該酶在pH 3.5～9.0時仍保持60%以上的相對酶活，其他纖維素酶在pH 4.0～5.5時保持60%以上相對酶活，本研究中的纖維素酶相較于其他纖維素酶，該酶具有較廣的pH穩(wěn)定性[22-23]。

2.3.5 金屬離子對纖維素酶活力的影響

金屬離子對纖維素酶活力的影響結(jié)果見圖8。

由圖8可知，Ag2+、K+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Co+對纖維素酶活力有顯著的促進作用，而Cu2+對纖維素酶活力有抑制作用。

圖8 金屬離子對纖維素酶活力的影響Fig.8 Effect of metal ions on cellulase activity

3 結(jié)論

本研究從西藏黃牛瘤胃中篩選出一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株N30，并通過形態(tài)觀察、生理生化鑒定和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其為燦爛類芽孢桿菌（Paenibacillus lautus）。菌株N30在發(fā)酵72 h時，纖維素酶活力最高，為15.6 U/mL。該纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，在10～35℃時保持較高的酶活力；最適pH為4.5，在pH 4.5時有最高的穩(wěn)定性，在pH 3.5～9.0時仍保持60%以上的相對酶活力；Ag2+、K+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Co+對纖維素酶活力具有促進作用，而Cu2+對纖維素酶活力有抑制作用。

菌株N30來自于西藏黃牛瘤胃，與其他從西藏地區(qū)動物胃腸道中篩選得到的產(chǎn)纖維素酶菌株的酶活相比，酶活較高。并且較于其他纖維素酶，該酶在更寬的溫度范圍內(nèi)保持較高酶活，溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性更高，因此，如將該菌株用作益生菌制劑的生產(chǎn)，應(yīng)用至當(dāng)?shù)啬翗I(yè)，會有較強的當(dāng)?shù)剡m應(yīng)性，效果更好，應(yīng)用潛力更大，可為西藏地區(qū)的農(nóng)牧業(yè)發(fā)展提供基礎(chǔ)。