王金鵬，韋元琪，朱 紅，錢偉祎，馬翔宇，崔 崟，周 華，蔡 恒*

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

酵母作為發(fā)酵工業(yè)中常用的菌株之一，在發(fā)酵過程中，自身代謝易受環(huán)境的影響，如高鹽會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分活度降低、細(xì)胞質(zhì)組成發(fā)生變化并伴隨細(xì)胞膜損傷等，從而使發(fā)酵過程難以進(jìn)行。但是，在發(fā)酵某些產(chǎn)品的后期，采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵能改善產(chǎn)品的風(fēng)味與口感，閆美[1]研究發(fā)現(xiàn)，在醬油釀造的發(fā)酵后期添加耐鹽酵母進(jìn)行高鹽稀態(tài)發(fā)酵，明顯改善了醬油的口感。謝韓等[2]在發(fā)酵醬油過程中添加耐鹽酵母，醬油的風(fēng)味變得鮮甜適口，酯香濃郁。此外，在醫(yī)學(xué)上耐鹽酵母可作為模式菌研究離子通道疾病如高血壓、心血管疾病等[3-4]。因此，從自然界中篩選出具有優(yōu)良耐鹽性能的酵母菌株，并對(duì)其耐鹽機(jī)理進(jìn)行研究在工業(yè)生產(chǎn)菌株性狀的改造[5]和藥物研發(fā)[6]方面都具有重要意義。

近年來對(duì)酵母耐鹽機(jī)理的研究已取得突破性進(jìn)展。高鹽使酵母細(xì)胞內(nèi)積累過量有毒陽離子，同時(shí)造成一定的滲透壓，使質(zhì)膜因細(xì)胞缺水而皺縮[7]。在鹽脅迫條件下，酵母細(xì)胞通過多種復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑將外界刺激傳入細(xì)胞核內(nèi)，激活特異性轉(zhuǎn)錄因子引發(fā)鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)，包括：將有毒陽離子排出胞外，提高質(zhì)膜對(duì)陽離子的選擇性吸收，如吸收K+[8-9]；調(diào)節(jié)一些相溶性物質(zhì)的積累，如海藻糖[10]、麥角固醇[11]、甘油[12-13]等，維持細(xì)胞一定的滲透壓。此外，細(xì)胞膜的成分變化以及膜完整性也會(huì)對(duì)酵母耐受能力產(chǎn)生一定的影響[14-15]，所以對(duì)細(xì)胞膜相關(guān)基因的研究也是一個(gè)熱點(diǎn)。趙經(jīng)文等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，在酵母質(zhì)膜和細(xì)胞器表面都存在相應(yīng)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要負(fù)責(zé)運(yùn)輸K+、Na+等金屬陽離子，并且膜上可能還存在特定的蛋白能幫助這些離子通道蛋白正確定位。ICT1基因編碼的蛋白屬于α/β水解酶蛋白，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，含有脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域和脂肪酶水解酶/?；D(zhuǎn)移酶域[18]。基于該發(fā)現(xiàn)，GHOSH A K等[19]對(duì)ICT1與磷脂代謝的關(guān)系進(jìn)行了研究，推測(cè)出一種可溶性脂質(zhì)生物合成途徑：在烷烴暴露條件下，誘導(dǎo)了基因ICT1的表達(dá)以及磷脂的合成，最終促使了細(xì)胞膜的修復(fù)。HUAL等[20]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜成分相關(guān)基因ICT1的敲除與過表達(dá)能夠提高酵母對(duì)烷烴極端環(huán)境的耐受性。因此，ICT1作為影響膜成分的基因，對(duì)酵母的耐受性至關(guān)重要。

本研究以釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）BY4741作為出發(fā)菌，采用同源重組技術(shù)構(gòu)建ICT1基因缺失釀酒酵母菌株，分析ICT1基因敲除對(duì)酵母耐鹽性的影響，并分別采用梯度點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色法、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-quantitativepolymerase chain reaction，RT-QPCR）等技術(shù)分析ICT1基因在釀酒酵母耐鹽機(jī)制中的作用。以期為后續(xù)酵母耐鹽機(jī)理的解析提供一定的理論基礎(chǔ)，并對(duì)濃醪發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌株性狀的改造具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

釀酒酵母（S.cerevisiae）BY4741：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；質(zhì)粒pUG6（攜帶Kanr抗性基因，兩端帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)，具有G418抗性）：廣西大學(xué)杜麗琴教授惠贈(zèng)。

1.1.2 引物

根據(jù)釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫（Saccharomycesgenome database，SGD）中ICT1基因（S000004089）和GenBank的pUG6序列（AF298793.1）設(shè)計(jì)引物，敲除引物命名為QC-F、QC-R，驗(yàn)證引物為A/YZ-a、YZ-b/B。引物均由南京金斯瑞有限公司合成，所涉及的引物及其序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物的序列Table 1 Sequences of primers used in the experiment

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH。去除瓊脂即為YPD液體培養(yǎng)基。

篩選培養(yǎng)基：每50 mL YPD培養(yǎng)基中加入500 μL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的G418母液。

鹽濃度梯度培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基中分別加入不同終濃度的NaCl（0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L）。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L。

以上培養(yǎng)基均需在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20min。

1.1.4 試劑

rTaq酶、PrimeSTAR@Max脫氧核糖核酸（deoxyri bonucleic acid，DNA）Polymerase（酶活2.5 U/μL）、DL2000 DNA Marker、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+plus）、5×PrimeScript RT Master Mix、2×qPCR Master Mix、ROXI染料、質(zhì)粒小量提取試劑盒、小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：日本TaKaRa公司；基因提取試劑盒、G418：生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TRGADIENT聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)Biometra公司；GPXcell 10-3000V電轉(zhuǎn)儀、170-8170凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；5804R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；leica DM2500IED熒光顯微鏡：德國(guó)徠卡公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 ICT1基因敲除組件的構(gòu)建

以質(zhì)粒pUG6為模板，采用引物QC-F、QC-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得同源臂ICT1基因敲除組件。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含G418抗性基因（kanr）及ICT1同源臂基因，堿基長(zhǎng)度約1 800 bp。

PCR擴(kuò)增體系：PrimeSTAR@Max DNA Polymerase 1 μL、dNTP 8 μL、5×Prime STAR Buffer 20 μL、QC-F 2 μL、QC-R2μL、DNA模板1μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至100 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

參照SAMBROOK J等[21]所述方法制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞。將含G418抗性（Kanr）及ICT1同源臂的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（約400ng）加入新制備的100μL釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯后冰預(yù)冷5 min，電轉(zhuǎn)化（電擊參數(shù)：電壓1.5 kV，電容25 μF，電阻400 Ω，電擊間距2 mm）。電轉(zhuǎn)化結(jié)束后立即加入1mL冰預(yù)冷的山梨醇復(fù)蘇，混勻，8000r/min離心1 min，棄上清，取100 μL濃縮液涂布于含100 μg/mL G418的YPD固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～3 d。

1.3.2 ICT1基因敲除重組菌的篩選與驗(yàn)證

挑取單菌落接種于含100 μg/mL G418的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h后，8 000 r/min離心1 min，收集菌體。采用基因提取盒試劑盒提取重組菌的基因組DNA，以其為模板，A/YZ-a和B/YZ-b為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)ICT1基因敲除菌進(jìn)行驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增體系：引物A/YZ-a（B/YZ-b）各2μL，Buffer2μL、rTaq酶10μL、DNA模板1 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，50℃（55℃）退火30 s，72℃延伸1min（2min），共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京金斯瑞公司測(cè)序。

引物對(duì)A/YZ-a、B/YZ-b以及整合“l(fā)oxP-kanMX-loxP”組建后的基因組相對(duì)序列如圖1所示。

圖1 引物與整合后的序列的相對(duì)位置關(guān)系Fig.1 Relative position relationship between primer and the integrated sequence

1.3.3 鹽耐受性試驗(yàn)

種子液的制備：將出發(fā)菌BY4741和驗(yàn)證成功的重組菌分別接種于10mLYPD液體培養(yǎng)基和含100 μg/mLG418的10mLYPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h后，采用無菌生理鹽水調(diào)整至相同菌體濃度。

耐鹽性測(cè)定：出發(fā)菌BY4741和重組菌的種子液經(jīng)梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）稀釋后，取3 μL稀釋液分別接種于含0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/LNaCl的YPD平板上，30℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌體生長(zhǎng)情況。

1.3.4 麥角固醇含量的測(cè)定[22]

麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以石油醚為溶劑制備質(zhì)量濃度為0.1g/L的麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于10 mL容量瓶中，石油醚定容至10 mL，在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定OD280nm值。以O(shè)D280nm值（y）為縱坐標(biāo)，麥角固醇質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

麥角固醇的提取：菌株BY4741和BY4741-ΔICT1在含不同濃度NaCl的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h后，分別取10 mL出發(fā)菌BY4741和重組菌BY4741-ΔICT1的菌液離心，8000r/min離心1 min，取沉淀，冰預(yù)冷的去離子水洗滌2次后轉(zhuǎn)入到50 mL錐形瓶中。加入2 g KOH、30 mL無水甲醇和5 mL無水乙醇，通入氮?dú)夥乐寡趸?5℃水浴提取30 min后取出，待冷卻后加入10 mL去離子水和10 mL石油醚進(jìn)行麥角固醇的萃取，劇烈振蕩10 min，靜置1 h，過濾。

麥角固醇含量的測(cè)定：吸取萃取試樣，測(cè)定其在波長(zhǎng)280 nm處的吸光度值，根據(jù)麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算麥角固醇含量，進(jìn)而得出單位質(zhì)量細(xì)胞內(nèi)麥角固醇含量。

1.3.5 細(xì)胞膜完整性的測(cè)定[23]

將出發(fā)菌BY4741和重組菌BY4741-ΔICT1接種于含1.0 mol/L NaCl的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，經(jīng)碘化丙啶（PI）染色后，采用熒光顯微鏡觀察兩株菌細(xì)胞膜的受損情況。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照Takara試劑盒步驟在4℃條件下提取重組菌的總核糖核酸（ribonucleicacid，RNA），以其為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）擴(kuò)增體系：5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL、RNA模板1 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至20μL。RT-PCR擴(kuò)增程序：37℃反轉(zhuǎn)錄15min；85℃熱變性30s；4℃保存。根據(jù)所測(cè)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因ENA1和NHA1的序列設(shè)計(jì)RT-QPCR引物，引物信息見表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物Table 2 Primers used for RT-QPCR

RT-QPCR擴(kuò)增體系：2×qPCR Master Mix 10 μL、正向引物（10μmol/L）0.2μL、反向引物（10μmoL/L）0.2 μL、ROXI染料 0.4 μL、cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。RT-QPCR擴(kuò)增曲線：95 ℃，5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃，5 s；60 ℃，31 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；95 ℃，15 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 ICT1基因敲除組件的構(gòu)建

以質(zhì)粒pUG6為模板，采用引物QC-F、QC-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得同源臂ICT1基因敲除組件，結(jié)果見圖2。

圖2 ICT1基因敲除組件PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR amplification products ofICT1gene knockout component

由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度約為1 800 bp，說明ICT1基因敲除組件構(gòu)建成功。

2.2 ICT1基因敲除重組菌株的構(gòu)建

采用電轉(zhuǎn)化法將ICT1基因敲除組件轉(zhuǎn)化至釀酒酵母BY4741中。由于ICT1基因敲除組件中包含異源顯性的Kanr標(biāo)記基因，將ICT1基因敲除組件轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞后，其兩端與酵母基因組同源的序列進(jìn)行同源重組，最終以loxP-Kanr-loxP取代基因組中的ICT1基因，從而賦予轉(zhuǎn)化子G418抗性。在含G418的YPD平板上培養(yǎng)2～3 d后獲得轉(zhuǎn)化子，結(jié)果見圖3。

圖3 ICT1基因敲除重組菌株Fig.3 Recombinant strains withICT1gene knockout

由圖3可以看出，在含G418的YPD平板上明顯長(zhǎng)出了轉(zhuǎn)化子，但為避免假陽性的存在，進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2.3 ICT1基因敲除重組菌的驗(yàn)證

提取轉(zhuǎn)化子BY4741-ΔICT1的基因組，分別以A/YZ-a、B/YZ-b為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正確整合了ICT1基因敲除組件的細(xì)胞以引物對(duì)A/YZ-a為引物時(shí)，可得到堿基長(zhǎng)度為250 bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以引物對(duì)B/YZ-b為引物時(shí)，可得到堿基長(zhǎng)度為850 bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

圖4 ICT1基因敲除重組菌株的驗(yàn)證Fig.4 Verification of recombinant strain withICT1gene knockout

由圖4可知，以引物對(duì)A/YZ-a為引物時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度為250 bp左右；以引物對(duì)B/YZ-b為引物時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度為850 bp左右，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)化子BY4741-ΔICT1中的ICT1基因已被敲除。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京金斯瑞有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，ICT1基因敲除組件已被完全整合到染色體上，進(jìn)一步說明ICT1基因已被敲除。

2.4 菌株BY4741和BY4741-ΔICT1的鹽耐受性測(cè)定

不同稀釋度的出發(fā)菌BY4741和重組菌BY4741-ΔICT1在鹽濃度梯度培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見圖5。

圖5 菌株BY4741與BY4741-ΔICT1在不同NaCl濃度平板上的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth situation of strain BY4741 and BY4741-ΔICT1on the plates with different NaCl contents

由圖5可知，與出發(fā)菌BY4741相比，重組菌BY4741-ΔICT1對(duì)NaCl更為敏感。經(jīng)0.4 mol/L NaCl處理后，兩株菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)較為接近，隨著NaCl含量的增加，重組菌BY4741-ΔICT1的生長(zhǎng)明顯受到抑制，說明ICT1基因的敲除提高了釀酒酵母對(duì)鹽的敏感性。

2.5 菌株BY4741和BY4741-ΔICT1在不同鹽濃度下麥角固醇含量的測(cè)定

以麥角固醇質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，OD280nm值（y）為縱坐標(biāo)，繪制麥角固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸擬合后得到的回歸方程為y=24.286 6x+0.055 6，R2=0.999 2，說明麥角固醇質(zhì)量濃度與OD280nm值呈良好的線性關(guān)系，可用于麥角固醇含量的測(cè)定。

麥角固醇是酵母細(xì)胞膜中的主要成分之一，能夠影響細(xì)胞膜的滲透性和流動(dòng)性，麥角固醇含量變化可影響膜內(nèi)外物質(zhì)的輸送[24]。菌株BY4741和BY4741-ΔICT1在含不同濃度NaCl的YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，測(cè)定菌株胞內(nèi)麥角固醇的含量，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨著NaCl濃度在0～1.0 mol/L范圍內(nèi)的增加，出發(fā)菌BY4741胞內(nèi)麥角固醇含量雖有所下降，但下降幅度較小，僅下降了11.2%；而重組菌BY4741-ΔICT1胞內(nèi)麥角固醇含量下降趨勢(shì)較為明顯，下降了66.9%。出發(fā)菌BY4741和重組菌BY4741-ΔICT1胞內(nèi)麥角固醇含量在不含NaCl的條件下差異不顯著（P＞0.05），但隨著NaCl濃度的升高，兩株菌的胞內(nèi)麥角固醇含量差異越大。結(jié)果表明，BY4741-ICT1基因的敲除使得胞內(nèi)麥角固醇合成減少，降低了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使得酵母在高鹽環(huán)境下難以生存。

圖6 不同NaCl濃度下菌株BY4741和BY4741-ΔICT1胞內(nèi)麥角固醇含量的測(cè)定結(jié)果Fig.6 Determination results of ergosterol contents in the cells of strain BY4741 and BY4741-ΔICT1under different NaCl contents

2.6 菌株BY4741和BY4741-ΔICT1細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

出發(fā)菌BY4741和重組菌BY4741-ΔICT1經(jīng)1.0 mol/L NaCl的YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細(xì)胞膜的受損情況見圖7。

圖7 1 mol/L NaCl條件下菌株BY4741（A）和BY4741-ΔICT1（B）細(xì)胞膜的受損情況Fig.7 Damage of cell membrane of strain BY4741(A)and BY4741-ΔICT1(B)under 1 mol/L NaCl

由圖7可知，經(jīng)1.0mol/LNaCl處理后，出發(fā)菌BY4741幾乎未被染成紅色，細(xì)胞膜受損程度很低，而重組菌BY4741-ΔICT1被染成紅色，細(xì)胞膜受損程度嚴(yán)重。由此可見，ICT1基因的敲除確實(shí)在一定程度上影響了細(xì)胞膜的完整性，進(jìn)而影響了酵母的耐鹽性。

2.7 菌株BY4741和BY4741-ΔICT1細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平

研究發(fā)現(xiàn)，與出發(fā)菌BY4741相比，重組菌BY4741-ΔICT1對(duì)NaCl比較敏感，細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，為研究ICT1基因的敲除是否對(duì)存在于細(xì)胞膜上的一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有影響，因此，采用RT-QPCR技術(shù)對(duì)與細(xì)胞膜上離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的兩個(gè)基因ENA1和NHA1進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定，結(jié)果見圖8。

圖8 菌株BY4741和BY4741-ΔICT1細(xì)胞膜上離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.8 Transcriptional levels of ion transporter gene on the cell membrane of strain BY4741 and BY4741-ΔICT1

由圖8可知，經(jīng)1.0mol/LNaCl處理后，與出發(fā)菌BY4741相比，重組菌BY4741-ΔICT1細(xì)胞膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，NHA1和ENA1基因的轉(zhuǎn)錄水平分別下降65.6%、90.5%，由此推測(cè)，ICT1的缺失影響了酵母轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在高鹽應(yīng)激時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平，降低了有毒陽離子向胞外運(yùn)輸?shù)乃俾剩瑥亩沟闷潲}耐受性下降。

3 結(jié)論

本研究以釀酒酵母BY4741為出發(fā)菌，利用同源重組技術(shù)敲除出發(fā)菌的ICT1基因，成功獲得了ICT1基因缺失菌株，命名為BY4741-ΔICT1。與出發(fā)菌BY4741相比，重組菌BY4741-ΔICT1對(duì)NaCl的耐受性減弱；經(jīng)1.0 mol/L NaCl處理后，麥角固醇含量下降66.9%，細(xì)胞膜嚴(yán)重受損，細(xì)胞膜上存在的兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHA1和ENA1轉(zhuǎn)錄水平分別下降65.6%和90.5%。說明ICT1基因的敲除，使得釀酒酵母鹽耐受性下降，可能與胞內(nèi)麥角固醇合成減少、膜受損、離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平下降有關(guān)，ICT1的缺失在影響膜成分的同時(shí)影響了離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)。

本研究明確了ICT1基因缺失破壞了酵母生物膜的完整性，降低了酵母細(xì)胞的耐鹽性，但其具體機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。本研究可為后續(xù)酵母耐鹽機(jī)理的解析提供一定的理論基礎(chǔ)，并對(duì)濃醪發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌株性狀的改造具有重要意義。