劉春梅，張印坡，楊娟

（1. 河南省漯河市中心醫(yī)院 病理科，河南 漯河462300；2. 漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002）

胃癌的發(fā)病率和病死率均位居我國(guó)惡性腫瘤的前列，其在男性中的發(fā)病率位居第二，病死率位居第三，在女性中發(fā)病率位列第五，病死率位居第二。胃癌已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民群眾生命健康的重大疾病[1-4]。因此，繼續(xù)深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，鑒定和篩選胃癌發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因，評(píng)價(jià)其作為胃癌早期診斷和治療的靶標(biāo)的潛能，具有重要的理論價(jià)值和臨床意義。

腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)等微環(huán)境的重塑，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的必要步驟[5-6]。細(xì)胞外基質(zhì)是由多聚糖、蛋白聚糖、糖蛋白、膠原蛋白及纖黏連蛋白等多種大分子物質(zhì)組成。膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)中最重要的結(jié)構(gòu)類蛋白，在腫瘤微環(huán)境的整體調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[7-8]。目前，已經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)28種已知的膠原蛋白，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)及裝配方式，可分為纖維膠原、非纖維狀膠原及微纖維膠原等三大類型。目前，已證實(shí)多種類型的膠原蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[9-11]。在胃癌中，已證實(shí)COL1A1、COL1A2、COL4A1及COL11A1等多種膠原蛋白與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，部分可以作為其診斷和預(yù)后的分子靶標(biāo)[12-16]。因此，進(jìn)一步篩選和鑒定與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的膠原蛋白基因，對(duì)于提高胃癌的早期診斷水平和臨床治療療效具有積極意義。

本研究利用Oncomine等在線腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析了多種類膠原蛋白在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)差異，以期鑒定與胃癌相關(guān)的新的膠原蛋白基因，結(jié)果顯示XII型膠原蛋白編碼基因COL12A1在胃癌中顯著升高，提示其可能與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)；隨后利用免疫組化、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)，COL12A1在胃癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人胃癌細(xì)胞SGC7901系購(gòu)自中南大學(xué)細(xì)胞中心。RPIM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自于以色列BI（Biological Industries）公司。RNA提取試劑盒（RC101），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（R233），SYBR Green qPCR Master Mix（Q511）均購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司。COL12A1抗體購(gòu)買于上海生工生物工程有限公司。SP Rabbit HRP Kit免疫組化試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。COL12A1 siRNA序列和對(duì)照序列，配套的轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司。蛋白裂解液RIPA、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和CCK-8等試劑購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.2 臨床標(biāo)本

58對(duì)胃癌標(biāo)本及癌旁標(biāo)本收集于2016年12月—2018年6月期間在本院普通外科住院的胃癌手術(shù)患者，其中男30例，女28例；年齡30～65歲，平均年齡（51.41±10.23）歲。標(biāo)本收集時(shí)，同一份標(biāo)本一分為二，一部分立即于液氮中凍存，一部分于福爾馬林中固定，用于石蠟切片制作。所有標(biāo)本均經(jīng)病理確認(rèn)的胃癌初診患者，且收集時(shí)均未接受放療和化療等治療。所有標(biāo)本收集前，均已同患者簽署了知情同意 書(shū)，并獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析利用Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.oncomine.org），注冊(cè)賬號(hào)后，選擇篩選條件如下：Analysis Type：Cancer vs Normal Analysis，Cancer Type：Gastric Cancer。根據(jù)P＜0.05值篩選在胃癌中表達(dá)升高的膠原蛋白 基因，經(jīng)PubMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）進(jìn)一步檢索，排除已被報(bào)道與胃癌相關(guān)的膠原蛋白基因，最終選定COL12A1。利用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）基因表達(dá)分析工具驗(yàn)證COL12A1在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌預(yù)后的關(guān)系。

1.3.2 免疫組織化學(xué)分析石蠟標(biāo)本經(jīng)60 ℃烤片熔蠟1 h后，置于二甲苯中脫蠟2次，每次5 min;隨后進(jìn)行梯度酒精脫水（100%→100%→95%→85%→75%），每次5 min；最后經(jīng)蒸餾水中水化5 min。利用檸檬酸緩沖液進(jìn)行高壓修復(fù)后，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉液孵育10 min，PBS洗3次，每次3 min；加入養(yǎng)血清工作液，室溫孵育10 min，甩干后滴加COL12A1（1:50）抗體稀釋液，放置于濕盒內(nèi)，4 ℃過(guò)夜孵育；PBS洗3次，每次3 min；滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫孵育10 min，PBS洗3次后，進(jìn)行DAB顯色；顯色經(jīng)復(fù)染，脫水透明后，滴加中性樹(shù)膠，用蓋玻片封片，隨后鏡下觀察。根據(jù)染色強(qiáng)度和染色面積進(jìn)行定量分析，染色強(qiáng)度無(wú)著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分；陽(yáng)性細(xì)胞比例≤25%為1分，26%～ 50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；兩者得分之積為最終得分，分?jǐn)?shù)≥4分為高表達(dá)，＜4分為低表達(dá)[17]。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)利用含10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基，于5%CO237 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞。

1.3.4 siRNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞用胰酶消化，按1.5×105/孔的密度接種于6孔板中，保證轉(zhuǎn)染前細(xì)胞匯合度在30%～40%左右。根據(jù)廣州市銳博生物科技有限公司提供的siRNA轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)，利用不含血清的RPIM-1640配制siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物，轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換成含血清的新鮮培養(yǎng)基。

1.3.5 總RNA抽提及qPCR檢測(cè)根據(jù)RNA抽提試劑盒的說(shuō)明，抽提組織和細(xì)胞總RNA。隨后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；最后，根據(jù)SYBR Green qPCR Master Mix說(shuō)明，配制qPCR體系，檢測(cè)COL12A1在組織和細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平。所用qPCR引物如下：COL12A1上游引物5'-GGA GTG GAG CTG TTT GCT ATT-3', COL12A1下游引物5'-GAG AGT GAC TCA AAA TCT GCC A-3'；GAPDH上游引物5'-CTG GGC TAC ACT GAG CAC C-3'，GAPDH下游引物5'-AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG-3'[18]。

1.3.6 蛋白提取及Western blot檢測(cè)RIPA冰上裂解COL12A1敲低的SGC7901和對(duì)照細(xì)胞，持續(xù)15 min，經(jīng)離心，取蛋白上清保存。一部分利用BCA蛋白濃度試劑檢測(cè)試劑盒確定濃度，步驟參照說(shuō)明書(shū)。剩余部分按比例加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，冷卻后以30 μg/孔上樣，經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，經(jīng)封閉，一抗孵育，TBST洗滌，二抗孵育，TBST洗滌后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)中的方法，利用 CCK-8檢測(cè)COL12A1對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[19]。siRNA敲低COL12A1表達(dá)水平的SGC7901細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化離心收集細(xì)胞后，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種于96孔板，每種細(xì)胞各接種20個(gè)孔，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，每隔24 h（進(jìn)行4次共96 h），取5個(gè)孔，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱孵育1 h后，利用酶標(biāo)儀，于450 nm波長(zhǎng)下，測(cè)量各孔的吸光值，扣除空白本底后，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.8 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)siRNA敲低COL12A1表達(dá)水平的SGC7901細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，經(jīng)消化離心后，接種于6孔板，每孔1000個(gè)細(xì)胞，每種細(xì)胞各接種3個(gè)孔。細(xì)胞于培養(yǎng)箱內(nèi)，連續(xù)培養(yǎng)8 d后，取出細(xì)胞，PBS洗滌1次，甲醇固定15 min后，利用0.5%結(jié)晶紫染色15 min，經(jīng)自來(lái)水漂洗后，計(jì)算各孔的克隆數(shù)目，與鏡下觀察，＞50個(gè)細(xì)胞的克隆，計(jì)算為一個(gè)有效克隆。

1.3.9 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)siRNA敲低COL12A1表達(dá)水平的SGC7901細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化離心后，利用無(wú)血清的RPIM-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至50 000細(xì)胞/mL，于預(yù)鋪有Matrigel的Transwell上室中加入500 μL細(xì)胞懸液，下室中加入750 μL含5%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，利用甲醇固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染色15 min，經(jīng)自來(lái)水漂洗后，利用棉簽小心刮除Transwell小室上層的細(xì)胞，于顯微鏡下觀察，細(xì)胞穿過(guò)的情況，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算穿過(guò)細(xì)胞的平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS statistics 20.0和Graphpad prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)數(shù)資料利用χ2檢驗(yàn)或Fisher （n＜5）精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織中COL12A1表達(dá)的數(shù)據(jù)庫(kù)分析

基于Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析了不同數(shù)據(jù)集中，COL12A1在正常胃黏膜和胃癌組織中的表達(dá)水平。所有數(shù)據(jù)集均顯示，COL12A1在胃癌中的表達(dá)水平明顯升高，并選擇了具有代表性的一組數(shù)據(jù)展示[20]（圖1A）?；赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)，利用GEPIA工具進(jìn)一步驗(yàn)證COL12A1在胃癌中的表達(dá)，結(jié)果同樣顯示，COL12A1在胃癌組織中表達(dá)明顯升高（圖1B），但其表達(dá)水平在不同病理分期的胃癌組織中沒(méi)有明顯差異（圖1C）。隨后，利用GEPIA進(jìn)一步分析COL12A1表達(dá)水平與胃癌患者總生存期的關(guān)系，結(jié)果顯示，COL12A1高表達(dá)胃癌患者總生存期降低（圖1D）。

圖1 基于Oncomine與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析Figure 1 Oncomine- and GEPIA-based database analysis

2.2 COL12A1蛋白在臨床標(biāo)本中的表達(dá)

為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果，進(jìn)一步利用qPCR及免疫組化檢測(cè)COL12A1在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)和蛋白水平。qPCR結(jié)果顯示，COL12A1在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于其在癌旁組織中的表達(dá)水平（P＜0.001）（圖2）；免疫組化結(jié)果顯示，COL12A1在胃癌組織細(xì)胞中呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性染色；在癌旁組織細(xì)胞中呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)（圖3），COL12A1蛋白在胃癌組織中的高表達(dá)率明顯高于癌旁組織（表1）。

圖2 qPCR檢測(cè)COL12A1基因表達(dá)Figure 2 Detection of COL12A1 gene expression by qPCR

圖3 免疫組化檢測(cè)COL12A1蛋白表達(dá)（×200）Figure 3 Immunohistochemical staining for COL12A1 protein expression (×200)

表1 胃癌組織和癌旁組織中COL12A1的表達(dá)比較[n=58，n（%）]Table 1 Comparison of COL12A1 expressions between gastric and adjacent tissues [n=58, n (%)]

2.3 敲低COL12A1的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和侵襲的影響

為了分析COL12A1在胃癌中的功能，進(jìn)一步利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染特異性靶向COL12A1的siRNA進(jìn)入胃癌細(xì)胞SGC7901，敲低COL12A1的表達(dá)水平。經(jīng)qPCR結(jié)果及Western blot驗(yàn)證效果，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后SGC7901中COL12A1的基因與蛋白水平明顯降低（圖4），利用CCK-8、平板克隆實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了COL12A1對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，敲低COL12A1表達(dá)后，SGC7901的生長(zhǎng)速度顯著減慢（圖5A）、克隆形成能力明顯降低（圖5B）、細(xì)胞侵襲能力被明顯抑制（圖5C）。

圖4 COL12A1干擾效率檢測(cè)Figure 4 Determination of COL12A1 interfering effi cacy

圖5 COL12A1對(duì)SGC7901生長(zhǎng)、增值和侵襲能力的影響Figure 5 Infl uences of COL12A1 in growth, proliferative and invasion abilities of SGC7901 cells

3 討 論

不管在全世界范圍，還是在我國(guó)，胃癌都是發(fā)病率和病死率位居前列的惡性腫瘤[1-2]。隨著胃癌流行病學(xué)特征研究地深入、胃鏡等內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展以及臨床治療手段的進(jìn)步，胃癌患者的早診率有較大提升，預(yù)后水平相應(yīng)有所提升。但是鑒于胃癌階段癥狀與慢性胃炎等疾病的癥狀相似，患者本人健康意識(shí)及鑒別能力又相對(duì)缺乏，以及現(xiàn)有診斷篩查靶標(biāo)的局限性，仍導(dǎo)致大多數(shù)患者確診時(shí)已處于伴有淋巴結(jié)浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中晚期，嚴(yán)重限制了現(xiàn)有的臨床治療手段的療效和患者的預(yù)后質(zhì)量[21-22]。因此，在建立和推廣早期篩查意識(shí)的同時(shí)，著力開(kāi)發(fā)新的更有效的胃癌早期診斷標(biāo)志物兼具理論意義、臨床應(yīng)用價(jià)值及社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，其種類和表達(dá)量的穩(wěn)定是維持細(xì)胞和組織功能正常所必須。反之，膠原蛋白表達(dá)異常與多種病理過(guò)程相關(guān)，尤其是惡性腫瘤[6-7]。目前關(guān)于膠原蛋白與腫瘤關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道，幾乎涉及了所有組織來(lái)源的實(shí)體瘤和所有類型的膠原蛋白編碼基因或蛋白。同樣在胃癌中，多種膠原蛋白被證實(shí)與胃癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。比如，Li等[12]證實(shí)，與正常組織相比，COL1A2和COL1A1的表述水平在胃癌組織中顯著上調(diào)，進(jìn)一步分析證實(shí)，COL1A2和COL1A1表達(dá)水平與腫瘤大小及浸潤(rùn)程度正相關(guān)，與預(yù)后總生存期負(fù)相關(guān)。隨后，研究[14,23]進(jìn)一步驗(yàn)證了COL1A2與胃癌預(yù)后的關(guān)系。另外，COL18A1[24]，COL11A1[25]等膠原蛋白也被證實(shí)在胃癌中顯著升高，且與轉(zhuǎn)移正相關(guān)，與預(yù)后負(fù)相關(guān)。同時(shí)，IV型膠原蛋白水平被證實(shí)在胃癌患者血清中顯著升高，且與胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移正相關(guān)[26]。本研究基于已有的胃癌測(cè)序數(shù)據(jù)，結(jié)合臨床樣本驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)了VII膠原蛋白COL12A1在胃癌中同樣存在高表達(dá)，且與胃癌惡性生物學(xué)特征及預(yù)后明顯有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)膠原蛋白與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可以作為胃癌早期診斷和預(yù)后療效判斷的潛在標(biāo)志物。

對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，是為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的首要步驟。通過(guò)改變細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分和堆積方式，形成一個(gè)細(xì)胞極性改變、細(xì)胞間黏著連接更疏松的腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展[27-29]。因此，作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原蛋白在腫瘤的惡性進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。在胃癌中，miR-129-5p可以通過(guò)靶向抑制COL1A1的表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)和侵襲[13]。同樣，敲低COL11A1的表達(dá)，能顯著抑制胃癌細(xì)胞HGC-27的生長(zhǎng)、遷移和侵襲[16]。本研究同樣證實(shí)，敲低胃癌細(xì)胞SGC-7901中COL12A1的表達(dá)水平后，細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力被顯著抑制，細(xì)胞的侵襲能力也顯著降低，表明COL12A1同上述膠原蛋白一樣，具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的效應(yīng)，提示其可能在胃癌的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

綜合已有研究和本研究結(jié)果顯示，在胃癌中膠原蛋白主要呈集群式上升趨勢(shì)。那么是否這種集群式的上升，是否存在內(nèi)在聯(lián)系？在臨床應(yīng)用潛能評(píng)價(jià)時(shí)，是否多個(gè)膠原蛋白的聯(lián)合應(yīng)用具有更大的精確性？這些問(wèn)題都值得進(jìn)一步深入研究。