張秀秀， 國(guó)學(xué)紅， 喻艷琴， 朱衛(wèi)芳， 張 婷， 王嬋娟， 單可人， 何 燕*， 吳昌學(xué)*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.宿遷子淵司法鑒定所， 江蘇 宿遷 223800)

按語(yǔ)言學(xué)分類滿族屬阿爾泰語(yǔ)系滿-通古斯語(yǔ)族群，起源于東北最古老的民族肅慎[1]，其主體稱謂經(jīng)歷了肅慎、挹婁、勿吉、靺鞨、女真和滿族[2]。公元1644年，滿族建立了清朝。清初，因平定明王朝殘部反清勢(shì)力和吳三桂叛清，清軍兩次入黔(公元1648年和1680年)，并于戰(zhàn)后聚居在貴州畢節(jié)黔西、金沙、大方三縣結(jié)合部[3]，400 余年來(lái)以“小聚居”形式與當(dāng)?shù)仄渌谰用褡濉按箅s居”在一起。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是在基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，且具有遺傳穩(wěn)定，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[4]。Y染色體非重組區(qū)SNP位點(diǎn)稱為Y-SNP，在遺傳學(xué)上同一染色體上進(jìn)行共同遺傳的多個(gè)基因座上等位基因的組合稱為單倍型。在群體遺傳學(xué)中，祖先單倍型與所有后代單倍型合稱為一個(gè)單倍群，一個(gè)家族的所有 Y 染色體理論上都屬于一個(gè)單倍群。Y 染色體單倍群具有人群和地理區(qū)域差異，在人類學(xué)的背景下，可推斷未知樣本的種族或地理來(lái)源[5-7]， 或人群進(jìn)化、遷徙及相關(guān)歷史活動(dòng)[8]， 可有效評(píng)估群體的遺傳結(jié)構(gòu)[9]。因此，本文采用SNapShot法對(duì)70例貴州滿族男性個(gè)體22個(gè)Y-SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，探討世居貴州滿族人群的父系遺傳特征，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 樣本收集及 DNA 標(biāo)化

根據(jù)知情同意原則，從課題組已經(jīng)建立的貴州世居少數(shù)民族DNA樣本庫(kù)中，篩選出70例貴州滿族男性DNA樣本，入選標(biāo)準(zhǔn)為3 代內(nèi)無(wú)族外通婚史，個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系。每份DNA樣本用Thermo ScientificTMNanoDrop Lite分光光度計(jì)定量后，取少量標(biāo)化為20 mg/L作為實(shí)驗(yàn)的模板，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 Y染色體基因分型

1.2.1多重 PCR 擴(kuò)增及提純 依照國(guó)際系譜遺傳協(xié)會(huì)(international society of genealogy,ISOGG)在網(wǎng)站 https://isogg.org/tree/index.html上發(fā)布的Y單倍群系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以其基本分支 C- O 及其亞簇為主, 篩選出 M145、RPS4Y711、M89、M9、M214、M175、M119、P31、M95、SRY465、47Z、M122、M324、P201、M159、M7、M134、M133、M217、M48、M407、P53.1共22個(gè)Y-SNP 為研究靶點(diǎn)，參考文獻(xiàn)[10]分成 4 組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(引物序列及分組情況見(jiàn)表 1)。體系包括20 mg/L的模板DNA 1.5 μL、引物 MIX 15 μL、10 nmol/L dNTP 3.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、Taq DNA 聚合酶0.5 μL、1 mmol/L甜菜堿 1.0 μL(其作用表現(xiàn)為富含 GC 模板的PCR擴(kuò)增和提高 Taq DNA 聚合酶的穩(wěn)定性)、5 mmol/L MgCl21.0 μL、500 mg/L 牛血清蛋白(BSA)0.5 μL。循環(huán)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環(huán) 35 次；72 ℃ 7 min，產(chǎn)物置4 ℃保存。純化：第Ⅰ、Ⅱ組PCR 產(chǎn)物各取1 μL混合，加入1 000 U/L蝦堿酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)1 μL和1 000 U/L大腸桿菌核酸外切酶Ⅰ(exonuclease,ExoⅠ)1 μL，37 ℃ 70 min后75 ℃ 15 min，即得純化后的多重 PCR產(chǎn)物，4 ℃保存，充當(dāng)單堿基擴(kuò)增時(shí)A組的模板。第Ⅲ、Ⅳ組擴(kuò)增產(chǎn)物也如法純化，充當(dāng)單堿基擴(kuò)增時(shí) B 組的模板。

1.2.2SNapShot 單堿基擴(kuò)增及純化 分A、B兩組進(jìn)行單堿基擴(kuò)增(分組情況及引物信息見(jiàn)表2)。體系包括模板 0.75 μL、SNapShot Mix 1.25 μL、單堿基擴(kuò)增引物 MIX 0.5 μL。循環(huán)條件為96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán) 28 次，產(chǎn)物4 ℃保存。純化：?jiǎn)螇A基擴(kuò)增產(chǎn)物加入1 000 U/L的SAP0.5 μL，混勻，瞬時(shí)離心，37 ℃ 70 min后75 ℃ 15 min滅活酶，即得純化后的 SNapShot 單堿基延伸產(chǎn)物，4 ℃保存。

1.2.3ABI 3130 毛細(xì)管電泳檢測(cè) 純化的單堿基延伸產(chǎn)物0.5 μL、GeneScan-120LIZ Size Standard 0.05 μL 和 Hi-DiTM甲酰胺 9.45 μL，混勻、離心并用ABI 3130遺傳分析儀(applied biosystems)進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，ABI 3130 Genetic Analyzer Data Collection Software v3.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算22個(gè)Y-SNP等位基因頻率、單倍型頻率與單倍群頻率。單倍型多樣性(HD)和基因多樣性(genetic diversity，GD)根據(jù)公式HD或GD=n(1-ΣPi2)/(n-1)(Pi為單倍型頻率或單倍型頻率，n為樣本數(shù))計(jì)算。運(yùn)用 SPSS 24 軟件進(jìn)行主成分分析(principle component analysis, PCA)，根據(jù)單倍群頻率用 Arlequin3.5軟件計(jì)算13個(gè)群體的遺傳距離Fst值，MEGA 7.0軟件根據(jù)Fst值用Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 篩選出的22個(gè)Y-SNP位點(diǎn)的多重PCR引物和SNapShot單堿基擴(kuò)增引物Tab.1 The sequences of Multiplex PCR primers and SNapShot microsequencing primers for 22 SNPs on Y-chromosome

2 結(jié)果

2.1 貴州滿族人群22個(gè)Y-SNP的遺傳多態(tài)性

采用SNapShot法對(duì)貴州滿族人群22個(gè)Y-SNP位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所分析的22個(gè)Y-SNP位點(diǎn)中，P53.1位點(diǎn)較為特殊、測(cè)出結(jié)果均為C/T相同雙峰，無(wú)多態(tài)性，因此僅納入其它的21個(gè)Y-SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，通過(guò)直接計(jì)數(shù)法獲得其它的21個(gè)Y-SNP位點(diǎn)等位基因頻率(圖1)、基因多樣性(圖2)和單倍型頻率(表2)，分析發(fā)現(xiàn)除了47Z、RPS4Y711、SRY465、M407、M159、M7、M217、M48位點(diǎn)沒(méi)有多態(tài)性(GD=0.000 0)，其余13個(gè)SNP 位點(diǎn)均具有遺傳多態(tài)性，Y-SNP突變頻率為0.014 3～0.971 4、GD值為 0.028 6～0.492 3。22個(gè)Y-SNP位點(diǎn)單倍型共檢出11種(其中有3個(gè)單倍型是唯一單倍型)，頻率為0.014 3～0.371 4，HD值為0.740 4。依照國(guó)際系譜遺傳(international society of genealogy,ISOG)網(wǎng)站https://isogg.org/tree/index. html 上發(fā)布的Y單倍群系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行單倍群的劃分，通過(guò)直接計(jì)數(shù)法獲得單倍群頻率(見(jiàn)表3第1行)其中單倍群O*頻率高達(dá)0.942 4。

圖1 貴州滿族人群21個(gè)Y-SNP的基因頻率Fig.1 The frequencies of 21 Y-SNPs loci in Manchu population from Guizhou

圖2 貴州滿族人群21個(gè)Y-SNP的基因多樣性Fig.2 Genetic diversity values of 21 Y-SNPs loci in Manchu population from Guizhou

表2 貴州滿族人群21個(gè)Y-SNP組成的11種單倍型頻率分布(n=70)Tab.2 11 haplotype frequency distribution of the 21 Y-SNPs loci in Manchu Population from Guizhou

2.2 貴州滿族與12個(gè)少數(shù)民族的群體遺傳學(xué)分析

2.2.1貴州滿族與12個(gè)少數(shù)民族的主成分分析 將本次研究結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)道的12個(gè)中國(guó)少數(shù)民族人群的單倍群頻率進(jìn)行比較(表3)，運(yùn)用SPSS 24軟件進(jìn)行主成分分析(圖3)，在主成分分析三維圖上可以看到壯侗語(yǔ)族(水族、布依族、仫佬族)聚為一簇，苗瑤語(yǔ)族(畬族、苗族、瑤族)聚為一簇、滿-通古斯語(yǔ)族(錫伯族、鄂倫春族、遼寧滿族)與突厥語(yǔ)族(維吾爾、柯?tīng)柨俗巫?、哈薩克族)聚為一簇，而本研究的貴州滿族單獨(dú)為一簇。

2.2.2貴族滿族與12個(gè)少數(shù)民族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 貴州滿族和中國(guó)12個(gè)少數(shù)民族人群間的Fst值分布情況見(jiàn)表4?；?3個(gè)人群?jiǎn)伪度悍植碱l率用 Arlequin 3.5軟件計(jì)算出群體間的遺傳距離Fst值，結(jié)果顯示13個(gè)群體間的Fst值為0.031 3～0.691 1，貴州滿族與其他群體的Fst值介于0.162 8～0.497 2，其中貴州滿族與新疆錫伯之間的遺傳距離最小(0.162 8)，與內(nèi)蒙鄂倫春族之間的遺傳距離最大(0.497 2)，根據(jù) 13 個(gè)群體之間的遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖4。

圖3 貴州滿族和中國(guó)12個(gè)少數(shù)民族人群Y染色體主成分分析Fig.3 The principal component analysis of Y chromosome of Guizhou Manchu and 12 ethnic minority populations in China

表3 貴州滿族和中國(guó)12個(gè)少數(shù)民族Y染色體單倍群頻率Tab.3 Y-SNP haplotype frequencies of Manchu in Guizhou and 12 ethnic minority populations in China

表4 貴州滿族和中國(guó)12個(gè)少數(shù)民族人群間的Fst值 Tab.4 Fst values of Guizhou Manchu and 12 ethnic minority populations in China

注：“+”為P<0.05，“-”為P≥0.05；對(duì)稱軸上對(duì)應(yīng)的P值，對(duì)稱軸下是Fst值

圖4 用鄰接方法(NJ)構(gòu)建的貴州滿族和中國(guó)12個(gè)少數(shù)民族人群系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of Guizhou Manchu and 12 ethnic minority groups in China

3 討論

為了探討遷入并世居貴州的滿族人群的父系遺傳特征，本研究選擇了Y染色體非編碼區(qū)的22個(gè)Y-SNP 位點(diǎn)作為靶點(diǎn)，對(duì)70例貴州滿族無(wú)關(guān)男性個(gè)體進(jìn)行基因分型，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析?；蚨鄻有苑治鼋Y(jié)果顯示，22個(gè) Y-SNP位點(diǎn)中，P53.1位點(diǎn)測(cè)出結(jié)果均為雙峰，可能是由于該位點(diǎn)所在片段在其他基因片段中有重復(fù)片段，Hueles等[13]在報(bào)道中稱兩峰現(xiàn)象是由于第一次擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生了兩種不同的擴(kuò)增產(chǎn)物，而杜宏等[14]人推測(cè)該位點(diǎn)是被檢測(cè)人群中的序列差異而出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，究其原因還需進(jìn)行進(jìn)一步研究，其他21個(gè)Y-SNP位點(diǎn)均得到較好的分型結(jié)果，47Z、RPS4Y711、SRY465、M407、M159、M7、M217、P53.1、M48等9個(gè)Y-SNP 位點(diǎn)無(wú)多態(tài)性(GD=0.000 0)，具有遺傳多態(tài)性的13個(gè)Y-SNP 位點(diǎn)的突變頻率為 0.014 3～0.971 4，GD值為 0.028 6～0.492 3。21個(gè)Y-SNP位點(diǎn)所組成的單倍型共檢出11種，頻率為 0.014 3～0.371 4，HD 值為 0.740 4，可以看出 GD值和HD值都很低。影響群體遺傳結(jié)構(gòu)的因素有很多，包括人群的遷徙、自然環(huán)境、地理的隔離。提示貴州滿族遷入貴州時(shí)人群數(shù)量有限，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的遷移后到達(dá)新的領(lǐng)域適應(yīng)新環(huán)境時(shí)容易發(fā)生遺傳漂變，遵循適者生存原則，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的積累會(huì)出現(xiàn)奠基者效應(yīng)。同時(shí)，由于貴州境內(nèi)山巒起伏，地貌類型復(fù)雜，交通不便，相對(duì)封閉，與外界很少交流，導(dǎo)致Y-SNP的遺傳多樣性比原始民族低很多，因此可能出現(xiàn)瓶頸效應(yīng)，導(dǎo)致貴州滿族人群的GD值和HD值都很低。接下來(lái)對(duì)其進(jìn)行單倍群相關(guān)性分析，O2a2b1與NO1(R=0.826，P=0.001)、O1a(R=0.723，P=0.005)、O1b(R=0.826，P=0.001)、O2a (R=0.826，P=0.001)為顯著正相關(guān)。在本研究的貴州滿族70個(gè)男性個(gè)體中，單倍群O*頻率高達(dá)0.942 4，符合單倍群O*在中國(guó)人群中呈高頻分布[15]。

為了說(shuō)明貴州滿族與其他民族間的關(guān)系，本研究選取了已有報(bào)道的中國(guó)不同語(yǔ)族的12個(gè)少數(shù)民族與貴州滿族的單倍群頻率進(jìn)行主成分分析。在主成分分析三維圖上可以看到壯侗語(yǔ)族(水族、布依族、仫佬族)聚為一簇，苗瑤語(yǔ)族(畬族、苗族、瑤族)聚為一簇、滿-通古斯語(yǔ)族(錫伯族、鄂倫春族、遼寧滿族)與突厥語(yǔ)族(維吾爾、柯?tīng)柨俗巫?、哈薩克族)聚為一簇，而本研究的貴州滿族單獨(dú)為一簇。從語(yǔ)言學(xué)上分類，貴州滿族屬于滿-通古斯語(yǔ)族，從地理分布上來(lái)看，貴州滿族已世居南方(貴州省)；但在主成分分析中，該人群既不與滿-通古斯語(yǔ)族民族聚在一起，又不與貴州其他民族聚在一起，提示可能貴州滿族從其起源地開(kāi)始逐漸向外遷徙的同時(shí)，不斷地與其他民族發(fā)生基因交流，進(jìn)入貴州之后因?yàn)闀r(shí)間、語(yǔ)言、地理等原因雖與貴州其他少數(shù)民族發(fā)生基因交融，但仍然一定程度保留了本民族的基因特點(diǎn)，形成了獨(dú)特的遺傳結(jié)構(gòu)。課題組前期對(duì)9個(gè)人群線粒體 DNA 的單倍群頻率進(jìn)行主成分分析顯示，貴州滿族與南方民族聚為一簇，母系和父系遺傳標(biāo)記得到結(jié)果并不一致[16]。推測(cè)從北方遷徙到貴州的滿族可能主要是通過(guò)與當(dāng)?shù)仄渌褡宓呐酝ɑ椋优畡t主要隨父親保留了滿族的族源，從而形成了貴州滿族人群在母系遺傳上與當(dāng)?shù)孛褡灏l(fā)生了基因交融、而父系遺傳結(jié)構(gòu)則較大程度的保留了北方滿族特性的群體遺傳學(xué)特征。

根據(jù)13個(gè)人群?jiǎn)伪度河?jì)算出群體間的遺傳距離Fst值，由遺傳距離矩陣?yán)L制遺傳進(jìn)化樹(shù)。遺傳距離矩陣顯示貴州滿族與其他少數(shù)民族均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，13個(gè)群體之間的Fst在0.031 3～0.691 1，貴州滿族與其他群體的Fst值介于0.162 8～0.497 2，其中貴州滿族與新疆錫伯族之間的遺傳距離最小(0.162 8)，提示貴州滿族與新疆錫伯族親緣關(guān)系較近，這與百茹峰等[17]選擇11個(gè)Y-STR基因座對(duì)24個(gè)群體的分子遺傳學(xué)關(guān)系進(jìn)行分析顯示滿族與錫伯族的遺傳距離最小(0.012 4)的結(jié)果一致。在進(jìn)化樹(shù)的分析中壯侗語(yǔ)族聚為一支，然后與苗瑤語(yǔ)族聚為一大支，滿-通古斯語(yǔ)族與突厥語(yǔ)族聚為一大支，貴州滿族與新疆錫伯族聚為一支，進(jìn)化樹(shù)分析和主成分分析結(jié)果基本一致。

綜上所述，從父系遺傳結(jié)構(gòu)分析，貴州滿族既固有北方民族特點(diǎn)，又受到其他族群的影響，形成了父系獨(dú)特的遺傳特點(diǎn)，這與滿族復(fù)雜的民族演化進(jìn)程相符。