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        HPLC法測(cè)定硫酸黏菌素發(fā)酵液含量方法探討

        2019-05-08 11:24:02庫(kù)麗扎達(dá)木拉提
        草食家畜 2019年2期
        關(guān)鍵詞:菌素重復(fù)性發(fā)酵液

        庫(kù)麗扎達(dá)·木拉提

        (新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所,新疆 烏魯木齊 830063)

        硫酸黏菌素,又稱(chēng)硫酸黏桿菌素、硫酸抗敵素、克利斯汀、多粘菌素E、抗敵素等,分子式為C52H98N16O13·2H2SO4,分子量為1352。純品為白色或類(lèi)白色粉末,易溶于水。硫酸黏菌素是堿性多肽類(lèi)抗生素,主要用于防治敏感菌的感染和促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)。硫酸黏菌素可以與細(xì)胞膜脂蛋白游離磷酸鹽結(jié)合,使得細(xì)胞膜表面張力減小、通透性增加,導(dǎo)致胞漿外流,細(xì)胞死亡。硫酸黏菌素對(duì)革蘭氏陰性菌有強(qiáng)抑制作用,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌無(wú)作用。硫酸黏菌素發(fā)酵液毒性較低,不易造成藥物殘留,不易產(chǎn)生耐藥性。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 儀器

        高效液相色譜儀:Agi1ent1260(美國(guó)Agi1ent公司);百萬(wàn)分之一天平(Mett1er xs105);5 mL一次性注射器。

        1.1.2 試劑和試藥

        甲醇(色譜純,賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司),乙腈(色譜純,賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司),水(超純水),磷酸(分析純,北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司),無(wú)水硫酸鈉(分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為 20170314,含量為 E1:29.6%,E2:50.3%,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),硫酸黏菌素發(fā)酵液(發(fā)酵放罐樣品):規(guī)格根據(jù)發(fā)酵液發(fā)酵的不同時(shí)段有不同的效價(jià)。

        1.1.3 溶液的制備

        1.1.3.1 稀磷酸(10%) 吸取7 mL磷酸到100 mL容量瓶,用水定容至刻度。

        1.1.3.2 緩沖液 稱(chēng)取4.46 g無(wú)水硫酸鈉,加900 mL水,用10%稀磷酸調(diào)pH至2.4,再用水定容至1 000 mL,過(guò)濾,超聲,待用。

        1.1.3.3 混合溶劑 將水、乙腈按4∶1混合,過(guò)濾,超聲,待用。

        1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

        將25 mg硫酸粘菌素標(biāo)準(zhǔn)品用混合溶劑溶解并定容至50 mL,搖勻,即得硫酸粘菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.5 mg/mL)。

        1.1.5 樣品處理

        取發(fā)酵放罐樣品濾液2.5 mL,置50 mL容量品中,用超純水稀釋至刻度,使用混勻機(jī)充分混勻,并使用微孔濾膜過(guò)濾。

        1.2 方法

        高效液相色譜法。

        1.2.1 色譜條件

        色譜柱為C18,4.6 mm×150 mm,3 μm,流動(dòng)相為用250 mL容量瓶量取乙腈至刻度,依次用20 mL及10 mL移液管共移出乙腈30 mL,將剩余220 mL乙腈全部移至1 000 mL容量瓶中,加緩沖液至刻度后,再添加3 mL乙腈,混勻,過(guò)濾,超聲,流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm,進(jìn)樣量20 μL。

        1.2.2 含量測(cè)定

        首先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液兩針,記錄相關(guān)峰面積,再進(jìn)樣品溶液兩針,記錄相關(guān)峰面積,計(jì)算硫酸粘菌素發(fā)酵液含量(發(fā)酵120 h以上的效價(jià),應(yīng)≥12 000 μg/mL)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 計(jì)算公式

        總含量(μg/mL)=E1含量+E2含量 (結(jié)果見(jiàn)圖 1、圖 2)

        2.2 高效液相色譜圖(硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品、樣品色譜圖)

        圖1 硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品

        圖2 硫酸黏菌素發(fā)酵液樣品色譜圖

        2.3 精密度試驗(yàn)

        取1.1.5項(xiàng)下硫酸黏菌素樣品溶液20 μL,按1.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)6次,記錄色譜圖峰面積結(jié)果見(jiàn)表1。硫酸黏菌素峰面積的RSD為0.11%,表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

        表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果表

        表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

        2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

        取按1.1.5項(xiàng)制備的6份供試品,按1.2.1色譜條件分析,記錄色譜圖,計(jì)算含量,平均值為10 660 μg/mL,RSD為0.18%,表明該方法中硫酸黏菌素的重復(fù)性良好,結(jié)果見(jiàn)表2。

        3 討 論

        用該方法測(cè)定硫酸黏菌素發(fā)酵液含量,同一樣品平行測(cè)定6次平均含量值為18 666.8 μg/mL,峰面積的RSD為0.11%;經(jīng)測(cè)定6個(gè)樣品含量平均值為18 886.7 μg/mL;RSD為0.80%;硫酸黏菌素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果RSD均在規(guī)定的范圍內(nèi),且有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

        4 結(jié) 論

        用HPLC法測(cè)定硫酸黏菌素發(fā)酵液含量,方法合理、操作便捷,適合于硫酸黏菌素發(fā)酵液的檢測(cè),并控制該產(chǎn)品的質(zhì)量,可作為硫酸黏菌素發(fā)酵液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),用于硫酸黏菌素的含量測(cè)定,以控制、保證產(chǎn)品質(zhì)量。

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