周麗云，李校天，李麗，楊俊超

肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化在肝纖維化的形成過程中起著重要作用[1-4]。miRNAs是一類長(zhǎng)度約18～25 nt的調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物，也包括單細(xì)胞生物體內(nèi)，參與細(xì)胞的分化、增殖和凋亡[5]。1，25（OH）2D3是維生素 D在體內(nèi)的最終代謝形式，是維持機(jī)體鈣和骨鹽平衡的重要成分，在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。本研究檢測(cè)了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織miR-146a水平，并在體外檢測(cè)了轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑/抑制劑并經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC的增殖和活化情況，以進(jìn)一步探討1，25（OH）2D3抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 48只SD大鼠【河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（合格證編號(hào):1602111）】，體質(zhì)量為（200±20）g，隨機(jī)分為對(duì)照組、CCl4模型組、橄欖油組和1，25（OH）2D3干預(yù)組，每組12只。給予大鼠50%CCl4（上海麥克林生物科技有限公司）3 ml·kg-1皮下注射，2次/w，連續(xù)8 w，建立肝纖維化模型，在對(duì)照組，給予等量的橄欖油溶媒皮下注射。自造模之日開始，在干預(yù)組，分別給予橄欖油溶媒或1，25（OH）2D3溶液（美國(guó)Peprotech 公司）3 ml·kg-1灌胃，1次/d。在實(shí)驗(yàn)第8 w，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟取血，4℃ 12000 r/m離心5 min，分離血清。打開腹腔，取肝組織，4%多聚甲醛固定，用于石蠟包埋制作病理學(xué)切片，采用Metavir法行肝纖維化分期評(píng)估。另取部分肝組織用液氮快速冷凍，置于-80℃冰箱保存，以備提取miR-146a。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取HSC細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心），用1640培養(yǎng)液加10%小牛血清（FBS，美國(guó)Invitrogen公司）、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，培養(yǎng)于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中，每24～48 h換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至T25培養(yǎng)瓶中約80%～90%時(shí)，胰酶消化傳代。當(dāng)傳至3～4代時(shí)，使用10 pmmol/l TGF-β1（美國(guó)Sigma公司）作用細(xì)胞24 h，將細(xì)胞分為：①TGF-β1刺激組：用含10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；②轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑組：用50 nM miR-146a模擬劑（廣州銳博生物科技有限公司）/10 pmmol/L TGF-β1/10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；③轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑對(duì)照組（廣州銳博生物科技有限公司）：用50 nM miR-146a模擬劑/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；④轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑組：用100 nM miR146a抑制劑（廣州銳博生物科技有限公司）/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；⑤轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑對(duì)照組：用100 nM miR146a抑制劑對(duì)照物（廣州銳博生物科技有限公司）/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；⑥1，25（OH）2D3干預(yù)組：用 2.5×10-6mmol/l 1，25（OH）2D3/0.1%DMSO 溶劑/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；⑦DMSO組：以 0.1%DMSO溶劑/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)我們前期工作基礎(chǔ)，設(shè)置藥物濃度及培養(yǎng)時(shí)間，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 肝組織miR-146a水平檢測(cè) 采用qPCR法。采用U6大鼠miR-146a源引物為內(nèi)參照，采用SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)miR-146a相對(duì)水平，miR-146a引物為：5’-TGAGAACTGAATTCCATGGG TT-3’，下游引物為 5’-ATCTACTCTCCAGGTCCTCA-3’；內(nèi)參基因 U6small nuclear RNA（snRNA）的上游引物為：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑和miR-146a抑制劑 瞬時(shí)離心miR-146a模擬劑、miR-146a模擬劑對(duì)照物、miR-146a抑制劑和miR-146a抑制劑對(duì)照物。用滅菌ddH2O配制成20 μM儲(chǔ)存液，分裝保存，用 1×riboFECTTMCP Buffer 30 μl分別稀釋 20 μM miR-146a模擬劑、miR-146a模擬劑對(duì)照物、miR-146a抑制劑和miR-146a抑制劑對(duì)照物1.25 μl，輕輕混勻，加入riboFECTTM CP Reagent 3 μl，輕輕吹打混勻，室溫孵育0～15 min。棄掉24孔板中的培養(yǎng)液，加入新的無血清培養(yǎng)基，將CP混合液加入到新的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。將培養(yǎng)板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.5 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK8法，將HSC-T6細(xì)胞接種于96孔板，體積100 μl，每組做3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，按照上述分組進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h左右，測(cè)定450 nm吸光度。細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）/（對(duì)照孔-空白孔）×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，按上述分組干預(yù)24 h，倒去培養(yǎng)液，胰酶消化，用培養(yǎng)液輕輕吹打，4℃ 1200 r/m離心5 min，棄上清，PBS洗2次，用Binding Buffer 500 μl重懸細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為5×105。用孔徑為40～50 μm的300目尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC 5 μl和PI 10 μl，輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育5 min，上機(jī)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間顯著性差異分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SD大鼠血清ALT和AST水平比較 經(jīng)1，25（OH）2D3處理，動(dòng)物血清 AST 和 ALT 水平顯著低于模型組（P＜0.05，表1），說明 1，25（OH）2D3具有保護(hù)大鼠肝功能，減輕肝損傷的作用。

表1 各組大鼠血清ALT和AST水平（±s）比較

表1 各組大鼠血清ALT和AST水平（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05；與橄欖油組比，②P＜0.05

ALT（U/L） AST（U/L）對(duì)照組 10 29.3±6.0 20.3±9.0模型組 10 353.3±128.6① 423.3±263.9①1，25（OH）2D3 11 86.7±12.6①② 56.7±15.3①②橄欖油組 12 376.7±150.4 416.7±255.4只

2.2 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn) Masson染色結(jié)果顯示，經(jīng) 1，25（OH）2D3灌胃干預(yù)后，SD 大鼠肝組織可見正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，炎性浸潤(rùn)情況較橄欖油灌胃組明顯減輕，匯管區(qū)纖維條索較橄欖油灌胃組明顯變細(xì)，說明1，25-OH）2D3具有抑制大鼠肝組織炎癥反應(yīng)作用。

2.3 各組大鼠肝組織miR-146a水平變化 經(jīng)1，25（OH）2D3灌胃干預(yù)組大鼠肝組織miR-146a水平較橄欖油處理組明顯上調(diào)（P＜0.05）。

2.4 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a情況 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑組細(xì)胞miR-146a相對(duì)水平較轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑對(duì)照物組顯著增高，轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑組miR-146a相對(duì)水平較轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑對(duì)照物組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示轉(zhuǎn)染成功。1，25（OH）2D3干預(yù) HSC中miR-146a水平較 DMSO組明顯增加（P＜0.05），提示 1，25（OH）2D3可上調(diào)細(xì)胞 miR-146a水平。

2.5 各組細(xì)胞增殖率比較 分別以2.5×10-6mmol/L 1，25（OH）2D3和 DMSO 處理細(xì)胞，以只含有 1640 培養(yǎng)基組為空白對(duì)照，處理 24 h 后，1，25（OH）2D3組細(xì)胞增殖率為58.8%，較DMSO組下降了15.9%；轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑組細(xì)胞增殖率為46.5%，較轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑對(duì)照組下降了53.3%；轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑組HSC增殖率為132.8%，較轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑對(duì)照物組升高了約32.8%，提示1,25（OH）2D3可抑制由TGF-β1刺激的HSC增殖。

2.6 各組細(xì)胞凋亡情況比較 1,25（OH）2D3干預(yù)細(xì)胞凋亡率為12.6%，比DMSO組細(xì)胞凋亡率提高了5.1%，與對(duì)照組比，細(xì)胞凋亡率增加了6.3%；轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑組細(xì)胞凋亡率為16.8%，與轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑對(duì)照物組比，細(xì)胞凋亡率增加了8.2%；與對(duì)照組比，轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑組細(xì)胞凋亡率增加了10.4%；轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑組細(xì)胞凋亡率為6.3%，與轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑對(duì)照物組比減少了 2.2%，提示 1，25（OH）2D3可促進(jìn)由 TGF-β1刺激的HSC細(xì)胞凋亡（圖1）。

圖1 各組HSC凋亡情況

3 討論

近年研究表明，miRNA參與肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程，有望成為肝纖維化診斷及干預(yù)的靶點(diǎn)[8]。miR-146a是miRNA家族的一員，位于人類5號(hào)染色體LOC285628基因的第二外顯子上。2006年，Baltimore團(tuán)隊(duì)首先報(bào)道了miR-146a可通過NF-κB信號(hào)通路抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)[9]。隨后，不斷有研究報(bào)告指出其與機(jī)體自身免疫、炎癥、病毒感染等有著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)miR-146a水平的異常與病毒復(fù)制、肝細(xì)胞再生、炎癥反應(yīng)，甚至肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系[10-14]。

1，25（OH）2D3與各種肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗纖維化等方面均有不同程度的作用。研究發(fā)現(xiàn)，1，25（OH）2D3可通過降低miR-27b水平從而抑制肺纖維化進(jìn)程[15]，還可通過調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)，誘導(dǎo)皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡[16]。國(guó)內(nèi)亦有用它來干預(yù)硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的報(bào)道[17]。我們采用10pmmol/L TGF-β1誘導(dǎo)HSC活化，再轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑或miR-146a抑制劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1，25（OH）2D3干預(yù)HSC細(xì)胞增殖較對(duì)照組明顯降低，而轉(zhuǎn)染miR-146a模擬劑組HSC增殖較對(duì)照組明顯降低，轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑組HSC細(xì)胞增殖較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn) 1，25（OH）2D3干預(yù)的HSC較對(duì)照組凋亡明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染 miR-146a模擬劑組 HSC 凋亡較對(duì)照組明顯增加，轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑組HSC較對(duì)照組凋亡減少，上述差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這些結(jié)果提示活化的 HSC細(xì)胞miR-146a較靜息狀態(tài)下下降，1，25（OH）2D3具有抑制肝纖維化的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)HSC中miR-146a水平有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，1，25（OH）2D3在體內(nèi)體外均具有抑制肝纖維化形成的作用，并且可能通過上調(diào)HSC細(xì)胞內(nèi)miR-146a水平而實(shí)現(xiàn)的，但其具體的信號(hào)通路還需要進(jìn)一步的研究。我們將在后續(xù)的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探索1，25（OH）2D3抗肝纖維化的作用機(jī)制及其miR-146a或其下游通路的作用，以期為1，25（OH）2D3用于抗肝纖維化的干預(yù)提供更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供更多的藥物干預(yù)思路，從而阻斷肝纖維化的進(jìn)展。