鐘娟，陳靜，青姚，吳曙粵，鐘慶榮△

糖尿病腎?。―N）是糖尿病（DM）全身微血管病變的腎臟表現(xiàn)，也是DM 最常見(jiàn)且最影響其預(yù)后的慢性并發(fā)癥。由DN所致的終末期腎臟疾病（ESRD）患者5年生存率低于20%，其已成為全球范圍內(nèi)ESRD 最主要的死亡原因，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康［1］。DN 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚未完全明了，且缺乏有效的治療藥物。川芎嗪（Ligustrazine，TMP）是從中藥傘形科植物川芎提取的總生物堿中分離的四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine），具有抗氧化、改善微循環(huán)、降血糖、抑制糖化產(chǎn)物的形成等藥理作用［2］，臨床上用于心、腦、腎及血管疾病等的治療。筆者的前期研究已證實(shí)，TMP 可以通過(guò)降低血糖、改善血液黏度以及抑制醛糖還原酶活性從而改善DN 大鼠腎損傷［3］。本研究擬從PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和自噬角度進(jìn)一步探討TMP對(duì)DN大鼠腎臟保護(hù)的作用機(jī)制，為DN的防治提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡雄性SPF 級(jí)SD 大鼠108 只，體質(zhì)量180～220 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK 粵2006-0015，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠均飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心層流架內(nèi)，置于空氣流通，溫度22～25 ℃，濕度40%～70%的環(huán)境中，給予12 h 光照，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。

1.1.2 藥物與試劑 川芎嗪片購(gòu)自北京市燕京制藥廠(chǎng)（50 mg/片，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H11021964，生產(chǎn)批號(hào)160106）；厄貝沙坦片購(gòu)自杭州賽諾菲制藥有限公司（150 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字J20080061，生產(chǎn)批號(hào)5A173）；鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma 公司），兔源一抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、pmTOR、LC3B購(gòu)自美國(guó)CST公司；鼠源一抗β-actin 以及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；尿微量白蛋白及尿肌酐檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 垂直電泳儀（美國(guó)Bio-RAD公司）；羅氏血糖儀（北京怡成生物電子技術(shù)有限公司）；microplate reader 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；日立7180 全自動(dòng)生化儀（深圳市永利鑫科技有限公司）；倒置顯微鏡XD101 型（南京江南光電股份有限公司）；Kodak Image Station 2000MM 成像系統(tǒng)（美國(guó)KODAK公司）。

1.2 方法

1.2.1 DN大鼠動(dòng)物模型建立 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)選取其中12只作為正常對(duì)照組，其余大鼠禁食12 h后，采用STZ腹腔注射，并予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，具體造模方法和成模標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［3］。造模過(guò)程中死亡率約為16%。

1.2.2 動(dòng)物分組及藥物干預(yù) 模型大鼠隨機(jī)分為模型組，TMP 低、中、高劑量組，厄貝沙坦組；另加正常組，共6 組（n=12）。TMP 分別按50、100、200 mg/（kg·d）灌服，厄貝沙坦予50 mg/（kg·d）灌服，模型組和正常組大鼠灌服等量生理鹽水，1次/d，療程為8周。

1.2.3 尿微量白蛋白與尿肌酐比值（UACR）檢測(cè) 各組在藥物干預(yù)前和干預(yù)后均進(jìn)行UACR 檢測(cè)，測(cè)量前禁食＞8 h，采集尿液標(biāo)本，尿液標(biāo)本采用酶法測(cè)定尿肌酐，免疫比濁法測(cè)定尿微量白蛋白，計(jì)算UACR。UACR以尿微量白蛋白（g）/尿肌酐（mol）表示。

1.2.4 腎臟病理檢查 在最后1 次給藥后，禁食12 h，稱(chēng)質(zhì)量，以0.3%戊巴比妥鈉按35 mg/kg腹腔注射麻醉，摘取腎臟，去除腎外層包膜，取厚度約4 mm腎組織，4%甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，再分別予蘇木素-伊紅（HE）和過(guò)碘酸-雪夫（PAS）染色，光鏡下進(jìn)行觀(guān)察、拍照。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路及自噬標(biāo)志蛋白LC3B 的表達(dá) 取凍存的腎組織，稱(chēng)質(zhì)量后在研缽內(nèi)用液氮迅速將組織研磨成粉末，將研磨的組織粉末轉(zhuǎn)移到EP 管中。每50 mg 腎組織加入400μL RIPA 裂解液（含4μL磷酸酶抑制劑、4μL蛋白酶抑制劑），按蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總蛋白，采用BCA 蛋白定量法測(cè)各組蛋白濃度。Western blot 實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［4］，以β-actin 為內(nèi)參，運(yùn)用Image Station 2000R圖像工作站取像，進(jìn)行條帶灰度分析。

1.2.6 免疫組化檢測(cè)各組腎組織LC3B的表達(dá) 各組腎組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定后自來(lái)水沖洗5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后浸蠟和包埋，切取2μm的石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水洗后，現(xiàn)配3%H2O2，室溫孵育20 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗3 次后，取兔抗LC3B一抗工作液（1∶100）50μL覆蓋組織片，置濕盒中蓋上蓋防蒸發(fā)，室溫孵育60 min；PBS 漂洗3 次，滴加二抗，室溫孵育30 min；PBS 漂洗3次后，配制DBA 顯色劑，室溫孵育5 min，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加蘇木素液約2滴至組織片上，5 min后流水沖洗干凈，再滴加0.5%鹽酸乙醇1 滴，約10 s 后自來(lái)水沖洗。中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀(guān)察。每組取6張切片標(biāo)本，以出現(xiàn)清晰的淺黃色/棕褐色顆粒判定為陽(yáng)性，采用Image Pro Plus 6.0（IPP）軟件對(duì)目的蛋白的著色進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用Tukey 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMP 對(duì)DN 大鼠UACR 的影響 經(jīng)藥物干預(yù)前，模型組、厄貝沙坦組以及TMP 低、中、高劑量組與正常組相比，UACR 均顯著升高（P＜0.05），但模型組與TMP 低、中、高劑量組及厄貝沙坦組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)藥物治療8 周后，模型組大鼠UACR 與正常組相比顯著升高（P＜0.01），各給藥組UACR 均有不同程度的降低，但TMP 低劑量組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而TMP 中、高劑量組UACR 顯著低于模型組（P＜0.05），且TMP 中、高劑量組與厄貝沙坦組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示中劑量TMP的治療已能減緩DN大鼠UACR的升高，見(jiàn)表1。

Tab.1 Effects of ligustrazine on UACR in DN rats表1 川芎嗪對(duì)DN大鼠UACR的影響 （n=12，g/mol，±s）

Tab.1 Effects of ligustrazine on UACR in DN rats表1 川芎嗪對(duì)DN大鼠UACR的影響 （n=12，g/mol，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與厄貝沙坦組比較，P＜0.05

組別正常組模型組川芎嗪低劑量組川芎嗪中劑量組川芎嗪高劑量組厄貝沙坦組F治療前120.50±33.53 196.25±66.43a 199.94±71.41a 202.73±64.77a 198.37±68.02a 196.03±73.18a 2.973＊治療后131.04±53.58 350.32±96.50a 304.33±89.36ac 250.40±80.10ab 241.57±83.21ab 239.65±84.72ab 9.647＊＊

2.2 TMP 改善DN 大鼠腎臟病理的改變 DN 大鼠腎臟外觀(guān)腫脹、質(zhì)地變硬，經(jīng)HE 染色后光鏡下觀(guān)察模型組大鼠腎組織可見(jiàn)大量的蛋白管型，腎小管上皮細(xì)胞脫落及空泡變性，炎性細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)于腎間質(zhì)；PAS染色可見(jiàn)大量糖原沉積于腎小管和腎小球，腎小球系膜區(qū)擴(kuò)大、細(xì)胞外基質(zhì)顯著增多。但經(jīng)藥物干預(yù)后，中劑量TMP 組與模型組相比，腎小管損傷明顯減輕，腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增生顯著減少，見(jiàn)圖1、2。

2.3 TMP 對(duì)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路及自噬標(biāo)志蛋白LC3B表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)與正常組相比顯著增加（P＜0.05）；而自噬標(biāo)志蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值與正常組相比明顯降低（P＜0.05）。但經(jīng)TMP 干預(yù)后，DN 大鼠腎組織p-PI3K、p-Akt、pmTOR 表達(dá)顯著減少，而LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明顯升高，其中TMP 中、高劑量組與模型組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但TMP 中、高劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 免疫組化檢測(cè)TMP 對(duì)DN 大鼠腎組織LC3B 表達(dá)的影響 模型組大鼠腎組織LC3B 表達(dá)量與正常組大鼠相比顯著減少（P＜0.05），而經(jīng)中劑量TMP干預(yù)后，DN 大鼠腎組織LC3B 表達(dá)與模型組相比顯著增多（P＜0.05），與厄貝沙坦組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4、5。

3 討論

DN是由于長(zhǎng)期慢性高血糖導(dǎo)致的腎臟損害，臨床上以蛋白尿和進(jìn)展性腎功能不全為特征，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致ESRD 的首要原因，嚴(yán)重威脅患者生命健康。自噬是細(xì)胞應(yīng)對(duì)應(yīng)激情況而出現(xiàn)的一種非損傷性應(yīng)答反應(yīng)，通過(guò)對(duì)自身胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器和（或）物質(zhì)進(jìn)行包裹及吞噬，從而形成自噬小體，其進(jìn)一步與細(xì)胞溶酶體融合，發(fā)展為自噬溶酶體，降解包裹及吞噬物。通過(guò)細(xì)胞的自噬，降解的產(chǎn)物可以重新供給細(xì)胞利用或者排泄出細(xì)胞，因此自噬對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能以及代謝平衡有著重要的意義。參與自噬調(diào)節(jié)的信號(hào)通路復(fù)雜，其中以PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路最為典型［4-5］。

Fig.1 HE staining of renal tissues in four groups of rats(×200)圖1 各組大鼠腎組織蘇木素-伊紅（HE）染色情況（×200）

Fig.2 PAS staining of renal tissues in four groups of rats(×200)圖2 各組大鼠腎組織過(guò)碘酸-雪夫（PAS）染色情況（×200）

Fig.3 Effects of ligustrazine on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and protein expression of LC3B圖3 川芎嗪對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及自噬標(biāo)志蛋白LC3B表達(dá)的影響

Fig.4 Immunohistochemical staining of LC3B in renal tissues of rats(×200)圖4 免疫組化檢測(cè)TMP對(duì)DN大鼠腎組織LC3B表達(dá)的影響（×200）

Fig.5 Quantitative analysis of LC3B detected by immunohistochemistry staining圖5 LC3B免疫組化陽(yáng)性表達(dá)的定量分析

DM 時(shí)機(jī)體處于高血糖、高胰島素血癥、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等應(yīng)激狀態(tài)，通過(guò)自噬的調(diào)節(jié)可以增強(qiáng)機(jī)體的防御能力并減輕這些應(yīng)激所致的損傷，進(jìn)而延緩DM 及其并發(fā)癥的發(fā)生與進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，DN狀態(tài)下，腎臟PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被異常激活，自噬受到抑制，從而引起腎臟系膜細(xì)胞增殖、胞外基質(zhì)積聚，導(dǎo)致腎臟損傷、腎小球肥大［6］。此外，Lu等［7］研究報(bào)道PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的激活可加速DN大鼠腎纖維化的發(fā)生與惡化。因此，自噬的改變與DN的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，開(kāi)發(fā)具有調(diào)控自噬作用的藥物可能是預(yù)防或治療DN的新靶點(diǎn)。

TMP是提取自活血化瘀中藥川芎的一種生物堿成分，具有拮抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基、抗炎、抗微生物、改善血流動(dòng)力學(xué)、抑制糖化產(chǎn)物的形成以及調(diào)節(jié)免疫功能等生物學(xué)活性作用，大量臨床報(bào)道顯示TMP治療DN有著顯著的療效［8-9］。韓嬌艷等［10］和劉中祿等［11］研究還發(fā)現(xiàn)，TMP 可以通過(guò)抑制PI3K/Akt和mTOR 介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而降低前列腺癌PC3細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。并且，潘盼盼等［6］基于以上信號(hào)通路，觀(guān)察黃芪甲苷聯(lián)合TMP 對(duì)DM 大鼠的腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制，證實(shí)TMP 可以通過(guò)抑制Akt/mTOR 信號(hào)通路，降低固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）表達(dá)，從而改善DM 大鼠血糖、24 h 尿蛋白排泄、腎功能及腎臟病理改變，進(jìn)而對(duì)DM大鼠腎臟具有保護(hù)作用。此外，文獻(xiàn)報(bào)道TMP 還可以通過(guò)激活核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）和抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB），減輕DM 引起的腎損害［12］。本課題組前期研究也證實(shí)，TMP 可以通過(guò)降低血糖、改善血液黏度和抑制醛糖還原酶活性降低DN大鼠血尿素氮和肌酐水平、升高肌酐清除率［3］，但其具體作用的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步探究。

本研究擬從PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和自噬角度探討TMP 對(duì)DN 大鼠腎臟保護(hù)的作用機(jī)制。并且，本研究根據(jù)美國(guó)腎臟病基金會(huì)的倡議和國(guó)內(nèi)最近研究進(jìn)展［13-14］，采用UACR 替代傳統(tǒng)的24 h 尿蛋白定量檢查。而厄貝沙坦減少蛋白尿和保護(hù)腎功能的作用已得到國(guó)際公認(rèn)［15］，故作為陽(yáng)性對(duì)照藥。研究發(fā)現(xiàn)，DN 大鼠與正常組大鼠相比，UACR 顯著升高，經(jīng)8周干預(yù)后，各給藥組UACR 均有不同程度的降低，但TMP 低劑量組與模型組比較未見(jiàn)顯著差異，而TMP 中、高劑量組UACR 顯著低于模型組，且TMP 中、高劑量組與厄貝沙坦組間比較未見(jiàn)顯著差異，提示中劑量TMP的治療已能減緩DN大鼠UACR的升高。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)中劑量TMP 干預(yù)后，HE和PAS染色均顯示DN大鼠腎臟病理改變明顯減輕。而且Western blot 檢測(cè)模型組大鼠腎組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達(dá)與正常對(duì)照組相比顯著增加，而LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值較正常對(duì)照組明顯降低。但經(jīng)TMP干預(yù)后，DN大鼠腎組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 表達(dá)顯著減少，而LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明顯升高，其中TMP 中、高劑量組與模型組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但TMP 中、高劑量組之間比較未見(jiàn)顯著差異。此外，免疫組化進(jìn)一步證實(shí)中劑量TMP的治療顯著增加DN大鼠腎組織自噬標(biāo)志蛋白LC3B的表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，TMP可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，從而促進(jìn)腎臟自噬，進(jìn)而減輕系膜細(xì)胞增殖和胞外基質(zhì)積聚、改善DN大鼠腎臟病理改變，降低UACR，減緩DN的發(fā)生與進(jìn)展；而其有效劑量可以考慮為100 mg/（kg·d）。

綜上所述，TMP 能降低DN 大鼠UACR 的升高、改善腎臟病理改變，其發(fā)揮以上腎保護(hù)作用的機(jī)制可能與其抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)腎臟自噬有關(guān)。