曹冰雁，劉藝潔，武莉莉，費(fèi)喬曼，楊冰，張玲，喬衛(wèi)△

酸棗仁（Zizyphi Spinosae Semen，ZSS），又稱作棗仁、酸棗核，為鼠李科植物酸棗的干燥種子，多用于治療驚悸多夢、盜汗、虛煩不眠等癥。木蘭花堿，又名木蘭堿，在酸棗仁中含量較高［1］，但關(guān)于其抗抑郁作用的報(bào)道較少［2］。表觀遺傳是指在不改變核苷酸序列的前提下，通過對染色體等的可逆性修飾來改變基因的表達(dá)?？赡嫘孕揎棸―NA修飾、RNA沉默以及組蛋白修飾等方面［3］。其中組蛋白修飾常在相關(guān)酶的催化作用下，進(jìn)行甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等修飾［3］。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1，LSD1）是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白特異性去甲基化的酶。LSD1 與神經(jīng)細(xì)胞增殖、情緒表現(xiàn)、學(xué)習(xí)記憶等有關(guān)［4］。本研究采用慢性不可預(yù)見性溫和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)造模，觀察木蘭花堿對抑郁小鼠行為學(xué)的影響，并在基因與蛋白水平檢測LSD1含量的變化。

1 材料與方法

1.1 一般材料 （1）實(shí)驗(yàn)動物。健康雄性ICR小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（津）2005-0001。動物飼養(yǎng)溫度為24～28 ℃，自然晝夜節(jié)律光照，適應(yīng)7 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（2）儀器。Centrifuge 5810R 離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；TBE-1000A高速逆流色譜儀（上海同田技術(shù)有限公司）；Nano Drop?2000c（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；雙反應(yīng)模塊梯度PCR儀（美國Bio-rad 公司）；7500 Real-time PCR System（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；蛋白電泳槽（美國Bio-rad 公司）；多功能成像分析系統(tǒng)（英國UVItec分子生物成像系統(tǒng)）。（3）藥品及試劑。酸棗仁購自安徽亳州市藥都國草堂藥材店，經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院周曄教授鑒定為酸棗Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chou 干燥成熟的種子。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)提取分離得到酸棗仁中木蘭花堿（＞95%）；石油醚、乙醇、正丁醇、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純（天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司）；TRIzol?（美國Invitrogen 公司）；SYBR Green Master Mix 實(shí)時定量PCR 試劑盒（瑞士Roche 公司）；Revert AidTMReverse Transcription Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；兔源LSD1 單克隆抗體（英國Abcam 公司）；鼠源β-肌動蛋白單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG 二抗（美國Cell Signaling Technology公司）；ECL化學(xué)發(fā)光液（美國Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 健康雄性ICR小鼠共40只，按照體質(zhì)量編號，采用抽簽法將小鼠隨機(jī)分為4 組，即正常對照組（control 組）、抑郁模型組（PG 組）、木蘭花堿高劑量組（MH組）和木蘭花堿低劑量組（ML組），每組10只。根據(jù)小鼠體質(zhì)量進(jìn)行灌胃給藥，MH 組給予藥17.3 mg/（kg·d），ML 組給予藥7 mg/（kg·d），control 組、PG 組給予等量蒸餾水。于每日8:00—9:00灌胃1次。采用21 d慢性不可預(yù)見性溫和刺激構(gòu)建小鼠抑郁模型，除control 組外，其余組小鼠在21 d 內(nèi)隨機(jī)安排10 種應(yīng)激因素，每天給予任意2 種刺激，為避免小鼠產(chǎn)生適應(yīng)性，平均每種刺激給予4次。刺激方式包括潮濕飼養(yǎng)12 h、無墊料飼養(yǎng)12 h、冷水游泳（25 ℃）6 min、傾斜12 h、晝夜顛倒、夾尾1 min、熱水游泳（45 ℃）6 min、睡眠剝奪12 h、禁食12 h、禁水12 h［5］。

1.2.2 懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST） 將小鼠尾尖端1/3處固定在懸尾箱內(nèi)，使動物呈懸空倒掛狀，懸掛兩側(cè)用隔板擋住小鼠視線。動物為克服不正常體位而掙扎活動，但當(dāng)感覺無望后，停止掙扎。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行6 min，記錄后4 min 內(nèi)的不動時間。

1.2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST） 將小鼠單獨(dú)放在盛有溫水的深10 cm、直徑18 cm透明玻璃缸中，水溫25 ℃。小鼠入水后會掙扎試圖逃跑但又無法逃脫，感覺無望后，僅將頭露出水面四肢呈不動狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6 min，記錄后4 min內(nèi)小鼠的不動時間。

1.2.4 小鼠腦組織總RNA 的提取以及逆轉(zhuǎn)錄 取小鼠腦組織，加入TRIzol?試劑，按照說明書提取總RNA。用Nano Drop?2000c 測定RNA 濃度。加入相應(yīng)的引物，使用Revert AidTMReverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR 按照SYBR Green Master Mix說明書進(jìn)行操作，PCR反應(yīng)體系為：SYBR Green Master Mix 10μL、上下游引物（10μmol/L）各0.2μL、cDNA 1μL、H2O 8.6μL。PCR引物序列如下：β-actin上游5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，下游5′-AATGTCACGCACGATTTCCC-3′；LSD1上游5′-CGACTTCCCCATGACCGAAT-3′ ， 下 游 5′- GAGTGGCTTCAAACGTCAGC-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃15 s，60 ℃40 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法處理數(shù)據(jù)。

1.2.6 Western blot 法檢測LSD1 的表達(dá)情況 將腦組織研碎，加入含蛋白酶抑制劑（Phenyl methane sulfonyl Fluoride，PMSF）的RIPA 裂解液提取總蛋白，之后測定蛋白濃度。根據(jù)各組所測蛋白濃度，加入4×SDS 上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，-20 ℃保存。將蛋白用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，采用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，使用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，分別加入兔源LSD1（1∶5 000）、鼠源β-肌動蛋白單克隆抗體（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，漂洗3次，每次10 min。加入相應(yīng)的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光液顯色。用image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.7 免疫組化法檢測LSD1 的表達(dá)情況 斷頭取腦組織，浸泡于10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)脫水、浸蠟，制成石蠟切片。切片脫蠟、水化后，抗原修復(fù)4 次，每次6 min；放置室溫后，3%H2O2去離子水室溫避光封閉10 min；山羊血清封閉15 min；滴加LSD1 抗體（1∶200），4 ℃過夜。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 聚合物，室溫20 min；DAB 顯色，蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化10 min；梯度脫水，中性樹膠封片，鏡下觀察，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木蘭花堿對抑郁小鼠不動時間的影響 與control 組相比較，PG 組小鼠的TST、FST 累計(jì)不動時間均延長（P＜0.05）。與PG組相比較，MH組、ML組小鼠的累計(jì)不動時間均縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Effects of magnoflorine on immobility time of mice表1 木蘭花堿對小鼠不動時間的影響 （n=10，±s）

Tab.1 Effects of magnoflorine on immobility time of mice表1 木蘭花堿對小鼠不動時間的影響 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與control組比較，b與PG組比較，P＜0.05

組別control組PG組MH組ML組F TST累計(jì)不動時間（s）54.59±22.97 92.10±19.59a 60.71±14.75b 70.60±17.05b 7.574＊＊FST累計(jì)不動時間（s）79.10±45.02 123.20±34.05a 59.50±25.44b 75.70±46.71b 4.985＊＊

2.2 木蘭花堿對腦部LSD1 表達(dá)的影響 在mRNA水平，與control組相比，PG組LSD1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ML 組LSD1 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與PG組相比，ML組LSD1表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。在蛋白水平，與control組相比，PG組LSD1表達(dá)明顯降低（P＜0.05），ML 組LSD1 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與PG 組相比，ML 組LSD1 明顯升高（P＜0.05），見表2、圖1。

Tab.2 Effects of magnoflorine on the expression of LSD1 of brain in three groups of mice表2 木蘭花堿對小鼠腦部LSD1表達(dá)的影響（n=3，±s）

Tab.2 Effects of magnoflorine on the expression of LSD1 of brain in three groups of mice表2 木蘭花堿對小鼠腦部LSD1表達(dá)的影響（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與control組比較，b與PG組比較，P＜0.05

組別control組PG組ML組F mRNA表達(dá)1.00±0.03 0.84±0.26 1.36±0.10ab 7.971＊蛋白表達(dá)0.47±0.02 0.37±0.01a 0.71±0.02ab 302.332＊＊

Fig.1 Effect of magnoflorine on the expression of LSD1 in brain of mice圖1 木蘭花堿對小鼠腦部LSD1蛋白表達(dá)的影響

2.3 小鼠腦部LSD1 免疫組化染色結(jié)果 PG 組LSD1 呈低表達(dá)，control 組、ML 組LSD1 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，見圖2。

Fig.2 Effects of magnoflorine on the expression of LSD1（immunohistochemistry staining,×400）圖2 木蘭花堿對LSD1表達(dá)的影響（免疫組化染色，×400）

3 討論

本研究采用CUMS 法建立小鼠抑郁模型，引起小鼠行為學(xué)、神經(jīng)免疫以及內(nèi)分泌等方面的改變，模擬出人類抑郁癥的形成，與人類抑郁癥癥狀相似［6］。酸棗仁具有鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗焦慮等多種藥理活性［7-8］。已有研究證實(shí)，酸棗仁總生物堿具有顯著的抗抑郁作用，可降低腦部單胺氧化酶的含量［9］，其中異喹啉型成分木蘭花堿的含量最高。據(jù)報(bào)道，異喹啉類生物堿在抗抑郁治療上有較好的應(yīng)用前景［10］。現(xiàn)有藥理研究表明，木蘭花堿具有抗氧化、抗心律失常、降壓等藥理作用［11-12］，但在抗抑郁方面報(bào)道較少，因此本研究以木蘭花堿作為研究對象，評價(jià)其潛在的抗抑郁作用。

抑郁小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，木蘭花堿能顯著改善CUMS小鼠的抑郁行為，而木蘭花堿高、低劑量組對于改善小鼠抑郁樣行為未見明顯差異。因此，本研究選擇木蘭花堿低劑量組進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究確認(rèn)，酸棗仁發(fā)揮抗抑郁作用最佳組分配伍配比為黃酮與生物堿部位1∶12～1∶14［13］。本實(shí)驗(yàn)中以藥典規(guī)定的酸棗仁每日用量12 g為依據(jù)，先折算成小鼠劑量后，根據(jù)2種最佳組分中木蘭花堿的含量計(jì)算出給藥高低劑量。本實(shí)驗(yàn)中木蘭花堿服用劑量低于藥代動力學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道的劑量［14］，對正常小鼠未見明顯不良反應(yīng)。

表觀遺傳學(xué)的修飾與調(diào)控研究逐漸成為生命科學(xué)的熱點(diǎn)，研究大多圍繞著腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病以及神經(jīng)疾病開展。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)研究中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，主要包括乙?；c甲基化研究。研究表明，組蛋白去乙?；敢种苿τ谏窠?jīng)疾病的治療具有較大的潛力［15］。目前組蛋白去甲基化酶研究大多圍繞著腫瘤［16］、心肌梗死［17］、炎癥［18］等進(jìn)行，而對神經(jīng)疾病治療的報(bào)道較少。由于組蛋白去甲基化酶LSD1 與單胺氧化酶具有緊密的同源關(guān)系，為單胺氧化酶家族的成員［19］，而單胺氧化酶抑制劑是目前臨床常用的抗抑郁類藥物，已有研究探索以LSD1 抑制劑治療抑郁癥［20-21］。本研究結(jié)果顯示，抑郁小鼠腦部的LSD1 含量降低，經(jīng)木蘭花堿治療后，在基因和蛋白水平上LSD1 的表達(dá)均升高，這與研究報(bào)道相反［20-21］。因此，在治療抑郁癥方面，主要是通過升高還是降低LSD1 表達(dá)仍未明確，需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，慢性應(yīng)激造模后，抑郁小鼠在TST及FST 行為學(xué)上不動時間延長，且LSD1 基因、蛋白的表達(dá)水平均下降。通過木蘭花堿治療后減輕了其抑郁樣行為，同時也提高了LSD1 的表達(dá)。說明木蘭花堿具有一定的抗抑郁效果，并且木蘭花堿可能是通過LSD1靶點(diǎn)發(fā)揮其抗抑郁治療作用。