陶冉，謝露，鄭君慧，譚小風，李諾，覃濤，楊葉桂，陳蒙華△

心 臟 驟 停（Cardiac arrest，CA）和 心 肺 復 蘇（cardiopulmonary resuscitation，CPR）后誘發(fā)的心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）可導致復蘇后嚴重心臟收縮功能障礙，進而影響患者的預后，而心肌收縮功能與心肌能量代謝密切相關，改善復蘇后心肌能量代謝可能有助于減輕復蘇后的心肌IRI［1-2］。細胞的生存和增殖受細胞外調節(jié)激酶1/2（ERK）信號通路的調控，有研究表明，在心臟局灶缺血再灌注損傷模型中，ERK 通路的激活能夠減輕心肌IRI［3］，而在多器官功能障礙的模型上，抑制ERK通路能夠減輕器官功能障礙［4］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，通過抑制ERK通路的激活可以減輕實驗大鼠神經細胞的IRI［5］。本研究擬在前期工作的基礎上，進一步研究ERK 通路的抑制劑PD98059對CA/CPR后心肌IRI和心肌能量代謝的影響，探索改善復蘇后心肌損傷的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 36只SPF級SD大鼠，體質量200～250 g，不拘雌雄（由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）。大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術（Sham）組（n=6）、模型（CA）組（n=15）和PD98059（PD）組（n=15）。Sham 組只單純行手術操作，不誘導CA/CPR；CA 組和PD 組誘導CA/CPR 并恢復自主循環(huán)（ROSC）后，PD 組立即靜脈注射PD98059（0.3 mg/kg），CA 組立即靜脈注射等量生理鹽水。

1.1.2 儀器與試劑 生物機能實驗系統(tǒng)BL-420F 購于四川成都泰盟儀器公司。小型動物呼吸機RWD407 購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司。Odyssey 成像系統(tǒng)購于美國LICOR 公司。PD98059 購于美國Sigma 公司。心肌肌鈣蛋白I（TNNI3）檢測試劑盒購于武漢優(yōu)爾生商貿有限公司。ATP檢測試劑盒、BCA 蛋白質測定試劑盒（Beyotime Biotechnology，China，P0010）購于碧云天公司（中國上海）。磷酸化ERK（p-ERK）抗體、ERK抗體、GAPDH內參抗體均購于Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 大鼠心臟驟停模型根據Chen 等［6］的研究施行。所有大鼠在術前禁食12 h，自由飲水。腹腔內注射10%水合氯醛（3 mg/kg）麻醉后、手術區(qū)備皮、消毒和行氣管插管后，監(jiān)測心臟節(jié)律。將2 根充滿5 IU/mL 肝素鈉鹽水的20號導管分別植入大鼠左側股動脈和左股靜脈中。將壓力傳感器連接到BL-420F 生物機能實驗系統(tǒng)并行心電和血壓監(jiān)測。在監(jiān)測基礎狀態(tài)心電圖和生理指數(shù)5 min 后，采用經食道交流電刺激誘導大鼠心臟發(fā)生心室顫動（VF）、建立CA/CPR后全心肌缺血再灌注損傷模型。CA成功判定標準：（1）平均動脈壓（MAP）＜10 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；（2）心電圖呈直線、室顫波形或者心臟有心電活動但是無脈搏搏動。CA 6 min 后，立即行CPR，ROSC 的恢復標準：室性節(jié)律并伴MAP≥50 mmHg，且持續(xù)≥5 min 以上［6-7］。ROSC 之后，PD 組立即靜脈注射PD98059（0.3 mg/kg），CA 組立即靜脈注射等量生理鹽水。繼續(xù)監(jiān)測生理指數(shù)1 h后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。記錄24 h內各組大鼠存活情況。于ROSC后24 h采集血樣并分離血清200μL凍存于-80 ℃低溫冰箱備用，將大鼠安樂死取左心室組織，一部分用于病理觀察，一部分用于生化檢測。

1.2.2 HE 染色病理觀察 取各組復蘇后24 h 心肌組織，經10%福爾馬林液固定后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后制作4μm厚度切片，對切片進行脫蠟、覆水，常規(guī)HE染色，封片，光學顯微鏡下觀察各組病理變化。

1.2.3 血清心肌肌鈣蛋白I 檢測 取ROSC 后24 h各組大鼠血清，使用心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒檢測肌鈣蛋白含量，操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 ATP 含量的測定 取ROSC 后24 h 各組心肌組織，按照ATP檢測試劑盒說明書檢測ATP水平。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測p-ERK 的表達 取-80 ℃保存心肌組織，勻漿，離心取上清液，通過BCA蛋白質測定試劑盒進行總蛋白質濃度檢測，然后與適量上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min，完全冷卻后，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移到PVDF 膜（0.22μm 孔徑），然后用5%脫脂牛奶封閉。用含有0.1%Tween 20 的Tris 緩沖液（TBST）洗滌5 min×3 次后，與ERK1/2（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶1 000）和內參蛋白GAPDH（1∶1 000）孵育過夜，TBST 洗滌后，再與Anti-rabbit IgG 二抗（1∶30 000）進一步室溫孵育2 h。通過3 次TBST 洗滌后，使用Odyssey 成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度。條帶用Image J軟件定量，量化值以GAPDH的百分比表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行LSD-t 檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-rank χ2檢驗比較各組累積生存率差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠24 h 生存情況比較 復蘇后24 h Sham 組全部存活（6/6）、CA 組6/15、PD 組13/15，PD組24 h 累積生存率較CA 組顯著提高（Log-rank χ2=12.533，P＜0.05），見圖1。

2.2 HE染色病理結果 Sham組心肌組織細胞排列整齊，細胞核呈橢圓形，位于心肌細胞中央，胞質均勻；CA組心肌組織呈現(xiàn)肌原纖維斷裂、排列紊亂，心肌細胞呈空泡變性，細胞質著色不均，胞核深染等病理性改變，細胞壞死明顯。PD組心肌組織排列尚規(guī)則，細胞輕度水腫，細胞破壞程度明顯減輕。見圖2。

2.3 血清心肌肌鈣蛋白I 水平 復蘇24 h 后，與Sham 組相比，CA 和PD 組血清心肌肌鈣蛋白I 水平顯著升高（P＜0.05）；PD組血清心肌肌鈣蛋白I水平較CA組明顯下降（P＜0.05），見圖3。

Fig.1 The comparison of cumulative survival between three groups圖1 3組大鼠累積生存情況比較

Fig.2 The comparison of hematoxylin-eosin staining results between three groups（×400）圖2 各組大鼠心肌組織HE染色結果（×400）

Fig.3 The comparison of the serum troponin I levels at 24 h of ROSC between three groups圖3 復蘇后24 h血清心肌肌鈣蛋白I水平

2.4 心肌ATP含量的變化 復蘇24 h后，CA組ATP含量明顯低于Sham 組（P＜0.05）；PD 組ATP 含量明顯高于CA組（P＜0.05），與Sham組差異無統(tǒng)計學意義，見圖4。

Fig.4 The comparison of heart ATP contents at 24 h of ROSC between three groups圖4 各組24 h心肌ATP含量的變化

2.5 大鼠心肌組織中p-ERK的表達 與Sham組比較，CA 和PD 組大鼠心肌組織中p-ERK 的表達水平明顯升高（P＜0.05）；PD組p-ERK的表達水平較CA組明顯下降（P＜0.05），見圖5。

Fig.5 The expression of p-ERK at 24 h of ROSC in three groups圖5 各組大鼠心肌組織中p-ERK的表達

3 討論

恢復自主循環(huán)的心臟驟?；颊呷砥鞴俳M織都經歷了一次缺血再灌注損傷打擊，其中，心肌IRI 的嚴重性在一定程度上決定了患者能否長期生存［8］。室顫是臨床上誘發(fā)心臟驟停最常見的原因。本研究采用電刺激法誘導大鼠發(fā)生心室顫動、建立CA/CPR模型，在一定程度上復制了臨床情況。組織學和血清心肌損傷標志物的檢測結果表明：6 min的心臟驟停時間足以造成明顯的心肌IRI。ROSC的大鼠接受PD 治療后，心肌病理損傷程度明顯減輕，心肌損傷標志物肌鈣蛋白I明顯下降，提示PD98059能夠改善心肺復蘇后心肌能量代謝障礙和減輕心肌IRI，進而改善復蘇大鼠的遠期生存狀態(tài)。

心肌IRI的產生機制非常復雜，誘發(fā)和加重心肌IRI的主要因素包括能量代謝障礙、細胞內外離子穩(wěn)態(tài)失衡、乳酸酸中毒、心肌舒縮功能障礙、自由基、鈣超載以及多種細胞激活的炎癥反應等［9-10］。其中心肌能量代謝的主要物質來源是線粒體所產生的ATP。當發(fā)生IRI 時，細胞內線粒體功能障礙，因而ATP 的生產過程也會受到影響，最終導致ATP 產生不足，勢必影響細胞的功能、代謝與生存［11］。有研究表明，心肌ATP的水平與其收縮能量呈正相關，而能量代謝的恢復能夠減輕細胞損傷也已被證實［12］。實施亞低溫治療心肺腦復蘇的重要保護機制之一就是減少細胞內ATP 消耗、增加其能量物質儲備［13-14］。本研究結果顯示，在復蘇后24 h，CA和PD組大鼠心肌細胞ATP 水平較Sham 組明顯降低，提示CA/CPR造成了心肌細胞損傷，進而致使ATP生成不足，導致心肌細胞能量代謝障礙。但給予PD治療后，大鼠心肌ATP 水平顯著升高。據此筆者認為PD98059 在CA/CPR 模型中可能通過發(fā)揮對心肌線粒體的保護作用，從而改善CPR 后心肌細胞的能量代謝水平和心肌IRI。

前期有大量研究顯示ERK 通路的激活能夠保護心肌細胞的IRI，但絕大部分基于心臟左前降支結扎的局灶損傷模型［15-16］；也有研究表明，ERK通路的抑制在多器官功能障礙的模型中具有保護作用［4］，而在心肺復蘇模型上ERK 通路的作用尚不明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ERK 通路的抑制能夠減少CA/CPR 大鼠模型腦細胞的凋亡，減輕大鼠腦IRI。本研究中亦發(fā)現(xiàn)ERK通路的抑制可以改善CA/CPR大鼠模型中心肌細胞損傷和能量代謝障礙，減輕其IRI。不同的實驗模型和不同的實驗條件可能是產生上述不同研究結果的重要原因，有待進一步研究驗證。

綜上所述，本研究采用的實驗模型在一定程度上復制了CA/CPR后心肌IRI的病理生理過程，并且證明了復蘇后早期應用PD98059能夠改善心肺復蘇后心肌能量代謝障礙和減輕心肌IRI。但本研究尚有不足之處，為了更好地保持實驗的同質性，本次納入的SD大鼠均屬于正常健康大鼠，而室顫往往更常見于具有各類心臟基礎病變的患者中，故不能完全反映臨床的真實情況。