黃雄偉業(yè),張紹東,歷俊華,王彬彬,馮潔,劉松,萬虹
首都醫(yī)科大學(xué),北京市神經(jīng)外科研究所,北京市100070
急性脊髓損傷多由車禍、高空墜落等原因造成,導(dǎo)致患者長期癱瘓,給家庭和社會帶來巨大經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和社會負(fù)擔(dān)[1-2]。脊髓損傷由外傷引起脊髓橫斷或壓迫引起,可分為原發(fā)性損傷與繼發(fā)性損傷:原發(fā)性脊髓損傷是外力直接或間接作用于脊髓所造成的損傷;繼發(fā)性脊髓損傷是指在脊髓損傷后2~48 h發(fā)生的損傷,主要病理變化之一是離子失調(diào)和興奮性毒性物質(zhì)釋放。離子失調(diào),特別是鈣離子濃度失調(diào),可引發(fā)鈣蛋白酶活化、線粒體功能障礙和自由基生成,導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡[3-4]。減輕繼發(fā)性損傷、防止其進一步惡化,對脊髓損傷后功能恢復(fù)非常重要[5]。
氯化鎂中的鎂離子為鈣離子的生理拮抗劑[6],能減弱鈣超載所造成的細(xì)胞損傷,是公認(rèn)的神經(jīng)保護劑,廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前對胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的保護[7]。
米諾環(huán)素化學(xué)名為二甲胺四環(huán)素,是第二代半合成四環(huán)素類藥物的衍生物,具有相對分子質(zhì)量小、親脂性高、可通過血-腦屏障、口服易吸收的特點,作為抗生素可用于治療牙周炎、痤瘡等疾病[8-10]。長期口服米諾環(huán)素?zé)o明顯不良反應(yīng),安全性好[11]。米諾環(huán)素對神經(jīng)系統(tǒng)有保護作用,可縮小損傷范圍,減輕軸突變性,加快運動功能恢復(fù)[12]。本研究探討米諾環(huán)素在急性脊髓損傷中,對繼發(fā)性損傷的神經(jīng)保護作用。
健康SPF雄性Sprague-Dawley大鼠24只,體質(zhì)量(190±20)g,由北京維通利華實驗動物有限公司提供,實驗動物許可證號SCXK(京)2016-0011。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d,室溫20~25℃,室內(nèi)光照,控制進食和水。
實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),并得到北京市神經(jīng)外科研究所動物倫理委員會的批準(zhǔn),審批文號201703004。
米諾環(huán)素、氯化鎂、聚乙二醇:英國ABCAM公司。苯巴比妥:法國CEVA公司。120602F壓迫水囊:FORGATY公司。Luxol Fast Blue(LFB)染色試劑盒:北京雷根生物技術(shù)有限公司。M400-E顯微外科手術(shù)顯微鏡:德國徠卡公司。Neuro-MEP-micr2電生理儀:俄羅斯NEUROSOFT公司。微量注射泵:北京普天益人醫(yī)療科技有限公司。T7.0動物磁共振儀:德國BRUKER公司。
水囊接三通,三通一端接改進的胰島素注射器,另一端接大氣。管內(nèi)注入生理鹽水,排除氣泡,注入生理鹽水35 μl,觀察球囊膨大正常,抽出生理鹽水。
大鼠予苯巴比妥1 ml/kg腹腔注射麻醉,俯臥,剃除背部毛發(fā),確認(rèn)棘突最高位置為T10;背正中切口,暴露T13棘突和椎板,切除棘突,在T12-13間小心去除椎板;從T12后緣與脊髓平行向頭側(cè)插入水囊18 mm,注入鹽水35 μl;30 s后打開三通,抽出水囊。分層縫合肌肉、筋膜和皮膚,置于溫箱中。大鼠蘇醒后單獨飼養(yǎng)2 d,然后合籠飼養(yǎng)。人工按摩腹部,直至恢復(fù)自主排尿、排便。
造模成功標(biāo)準(zhǔn):觀察雙側(cè)下肢完全癱瘓,并立即行動物磁共振檢查,影像學(xué)判定脊髓壓迫部位及損傷大小。剔除不成功者,并予補足。
大鼠造模前頸外靜脈置管。苯巴比妥1 ml/kg腹腔注射麻醉,頸部及相鄰背側(cè)備皮。大鼠仰臥,頸中線右側(cè)切口1 cm,暴露、分離頸外靜脈,置入自制留置輸液裝置,含有肝素的生理鹽水稀釋液封管。
造模成功的大鼠隨機分為鹽水組(n=8)、氯化鎂組(n=8)和米諾環(huán)素組(n=8)。分別稱取93.75 mg(劑量 1)、68.75 mg(劑量 2)、25 mg(劑量 3)米諾環(huán)素粉末,溶于生理鹽水10 ml中,震蕩溶解。米諾環(huán)素組術(shù)后第1天予劑量1,第2天予劑量2,第3~7天每天予劑量3,每天13:00靜脈注射。氯化鎂組和鹽水組術(shù)后當(dāng)天7:00、15:00、23:00各注射相應(yīng)藥物1次,直至術(shù)后第7天。
所有大鼠均以2 ml/kg、0.05 ml/min通過靜脈留置管給藥。
術(shù)后當(dāng)天開始,前兩周每兩天進行一次BBB評分[13],之后每周兩次BBB評分,持續(xù)到術(shù)后第31天。大鼠置空曠平地上自由活動,評分前適應(yīng)性活動3 min,觀察活動3 min進行評分。分別對左右腿進行評分,取均值。
完成BBB評分后,各組5只大鼠10%水合氯醛1 ml/kg腹腔注射麻醉,背部胸腹段及大腿備皮,俯臥位置于鼠板上,刺激電極置入硬腦膜外側(cè),接收電極置于腓腸肌,地線插入背部皮內(nèi),單次電信號刺激,1 Hz、0.1 ms方波,強度25~30 mA,接收電極記錄振幅,至少3次以上重復(fù)性好時,記錄保存。
各組取4只大鼠,麻醉及皮膚處理同上。切開背部皮膚,暴露棘突,找到損傷的椎骨,去除椎板,暴露T9脊髓,將接收電極從背側(cè)椎間隙插入到脊髓和椎骨間,明膠海綿固定。分離坐骨神經(jīng),將刺激電極插入坐骨神經(jīng)主干,地線插入背部皮內(nèi),重復(fù)電信號刺激,1 Hz、0.2 ms方波,強度4.5 mA,疊加50~100次,接收電極記錄振幅,至少3次以上重復(fù)性好時,記錄保存。
電生理檢測后,各組取3只大鼠4%多聚甲醛心臟灌注固定處死,取T9-11脊髓,4%多聚甲醛中后固定,脫水、浸蠟、包埋,切片,厚4 μm。常規(guī)脫蠟、入水,置95%乙醇中,加LFB染色液,室溫20 h。95%乙醇洗去多余染色液,蒸餾水沖洗,入Luxol液分色15 s,入70%乙醇分色30 s至灰白質(zhì)清晰;蒸餾水沖洗,伊紅復(fù)染,常規(guī)脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。ImageScope軟件掃描損傷面積最大、兩端含有正常脊髓結(jié)構(gòu)的切片,Image J軟件通過陽性區(qū)域閾值圈定范圍方式計算染色陽性區(qū)域面積。
采用GraphPad Prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均用(xˉ±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。
選造模術(shù)后雙下肢完全癱瘓、BBB評分為0的大鼠行磁共振檢查。冠狀位和水平位可見T2低信號,脊髓組織受壓、萎縮,周圍水腫(圖1)。
三組BBB評分均隨時間的推移逐漸增高。術(shù)后第2~14天組間無顯著性差異(P>0.05);術(shù)后第17~31天米諾環(huán)素組高于鹽水組(P<0.05),氯化鎂組與鹽水組和米諾環(huán)素組之間均無顯著性差異(P>0.05)。見表1。
米諾環(huán)素組運動誘發(fā)電位振幅高于鹽水組(P<0.05),氯化鎂組與鹽水組和米諾環(huán)素組之間均無顯著性差異(P>0.05)。見圖2、表2。
圖1 磁共振T2加權(quán)像
表1 各組大鼠BBB評分比較
各組間感覺誘發(fā)電位振幅無顯著性差異(P>0.05)。見圖3、表3。
米諾環(huán)素組損傷面積低于鹽水組(P<0.05),氯化鎂組與鹽水組和米諾環(huán)素組之間均無顯著性差異(P>0.05)。見圖4、表4。
表2 各組運動誘發(fā)電位比較(μV)
表3 各組感覺誘發(fā)電位比較(μV)
表4 各組損傷面積比較比較(mm2)
圖2 各組運動誘發(fā)電位波形圖
圖3 各組感覺誘發(fā)電位波形圖
圖4 各組損傷區(qū)域面積(LFB染色,bar=500 μm)
目前有多種制備脊髓損傷動物模型的方法,如重物墜落法脊髓挫傷模型、脊髓半橫斷或全橫斷損傷模型、牽拉性脊髓損傷模型等[14-16],這些動物模型都為開放性脊髓損傷,需手術(shù)去除椎骨和椎板,完全暴露脊髓,這種損傷方式臨床不可能發(fā)生。為了模擬臨床上常見的閉合性脊髓急性損傷[17],我們開發(fā)球囊壓迫大鼠脊髓背側(cè)急性損傷動物模型。此模型下,脊髓損傷面積和治療空間保持穩(wěn)定,有利于病理生理變化的觀察。我們還研發(fā)了一種實驗動物用靜脈留置輸液裝置,現(xiàn)已申報發(fā)明專利。
電生理是一種用于評價神經(jīng)傳導(dǎo)功能的檢測手段,振幅越高,神經(jīng)傳導(dǎo)功能越好[18-19]。本研究顯示,運動誘發(fā)電位振幅鹽水組最低,米諾環(huán)素組最高,氯化鎂組介于兩者之間,與BBB評分結(jié)果相似。說明脊髓損傷后運動功能的恢復(fù)與運動誘發(fā)電位檢測結(jié)果相符。而感覺誘發(fā)電位振幅各組間無顯著性差異,可能由于米諾環(huán)素主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),末梢感受器中濃度不高,作用不明顯。有待進一步研究。
米諾環(huán)素具有能穿過血腦屏障、口服易吸收以及神經(jīng)保護作用的特點,被用于諸多神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的治療研究中[20]。Wells等[21]首次報道,米諾環(huán)素對急性開放性脊髓損傷有保護作用,可縮小脊髓損傷范圍,減輕軸突變性,加快運動功能恢復(fù)。Teng等[22-23]報道,米諾環(huán)素對急性挫裂性脊髓損傷有治療作用,不僅可通過減少線粒體細(xì)胞色素C的釋放而減少細(xì)胞凋亡,還可加速大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。Aras等[24]發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素對大鼠開放性脊髓損傷的保護作用與其抗氧化激活機制有關(guān)。
由于米諾環(huán)素具有良好的脂溶性和能夠穿過血腦屏障,我們選擇緩慢持續(xù)靜脈給藥方式,使藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中保持穩(wěn)定的血藥濃度;由于米諾環(huán)素代謝排出率較低,大部分在體內(nèi)滯留,因此采用不同藥物濃度階梯給藥,后續(xù)僅需維持血藥濃度即可。這種給藥方式符合藥理學(xué)規(guī)律,也貼合臨床實際。
目前人們分別從神經(jīng)功能恢復(fù)、電生理檢測以及抗凋亡等方面,證明米諾環(huán)素對脊髓急性損傷具有保護作用[24-25]。本研究顯示,米諾環(huán)素和氯化鎂一樣,在脊髓急性損傷后可促進神經(jīng)功能恢復(fù),增強神經(jīng)傳導(dǎo),減少繼發(fā)性損傷面積。為今后臨床藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。