馬寧 ，王艷 ，彭薇 ，李昊 ，楊曉

1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心八一兒童醫(yī)院，北京市100700；2.出生缺陷防控關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京市100700；3.兒童器官功能衰竭北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市100700

耳聾是常見的感覺功能障礙，也是常見的致殘疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，2005年全球聽力殘疾人約2.78億。全國(guó)第二次殘疾人抽樣調(diào)查顯示，我國(guó)目前約有2780萬(wàn)聽力殘疾人，約占?xì)埣踩巳旱?3.5%[1]。由于人口基數(shù)巨大，每年大概新增6萬(wàn)~8萬(wàn)耳聾人口，中國(guó)耳聾發(fā)病率約1‰~3‰[2-3]。

耳聾的成因大致分為兩類：遺傳因素和環(huán)境因素，遺傳因素是耳聾的主因。遺傳性耳聾分為常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、線粒體遺傳(母系遺傳)和性染色體遺傳等，臨床上按其表現(xiàn)分為綜合征性耳聾和非綜合征性耳聾[4]，其中以非綜合征性耳聾為主，目前發(fā)現(xiàn)非綜合征性耳聾最常見的致聾基因是GJB2、SLC26A4、12S rRNA和GJB3[5-7]。

新生兒聽力篩查是常規(guī)聽力篩查措施，但難以有效發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性耳聾、藥物性耳聾和高頻聽力耳聾。針對(duì)非綜合征性耳聾進(jìn)行基因篩查，可以從分子生物學(xué)層面發(fā)現(xiàn)耳聾病因，真正做到早發(fā)現(xiàn)和早治療，采取有針對(duì)性的治療方案。全國(guó)已經(jīng)有多地開展新生兒常見耳聾基因突變篩查[8-12]。由于區(qū)域遺傳背景和地域隔離等因素影響，區(qū)域基因突變的攜帶率和突變譜各不相同。通過(guò)大規(guī)模基因篩查，可以了解區(qū)域耳聾基因致病位點(diǎn)的分布和發(fā)病情況，建立科學(xué)的預(yù)測(cè)模型，為耳聾防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選擇2018年1月至10月在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心八一兒童醫(yī)院出生的新生兒2545例足跟血樣本，于2018年11月至12月，在八一兒童醫(yī)院發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行十五項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)。

本研究已獲得中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器設(shè)備

干血斑基因組DNA提取試劑盒(DP334)：天根生化科技有限公司。NanQ分光光度計(jì)：博奧生物公司。十五項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒、SlideWasherTM24芯片洗干儀、Lux-scan 10K/B微陣列掃描儀：北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司。ABI Veriti聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀：美國(guó)THERMO‐FISHER公司。

1.2.2 干血斑DNA提取

參照DP334干血斑基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取樣本DNA，保存于-20℃冰箱中備用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

十五項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒中所涉及的15個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)分別分布在A、B、C三個(gè)擴(kuò)增體系中。各取三個(gè)擴(kuò)增體系20 μl，各加DNA 5 μl。擴(kuò)增程序如下：37℃10 min，95℃15 min，95℃30 s，0.4℃/s退火至57℃30 s，0.2℃/s退火至70℃45 s，循環(huán)35次；60℃10 min，12℃∞。

2 結(jié)果

共發(fā)現(xiàn)119例新生兒攜帶耳聾基因突變，其中GJB2突變攜帶者60例(2.36%)，男/女比30/30，其中235和299位點(diǎn)突變率較高，分別為1.77%和0.55%；還發(fā)現(xiàn)35位點(diǎn)雜合突變1例。SLC26A4基因突變攜帶者48例(1.88%)，男/女比26/22，IVS7-2位點(diǎn)突變率較高(1.45%)。線粒體12S rRNA基因突變攜帶者5例(0.20%)，其中1555位點(diǎn)有2例為異質(zhì)突變，需要判定其突變DNA占比。GJB3基因突變攜帶者5例(0.20%)。235雜合和IVS7-2雜合兩個(gè)位點(diǎn)突變1例(0.04%)。SLC26A4基因1174A>T、1229C>T和15+5G>A雜合突變各1例。見表1。

3 討論

遺傳性耳聾以非綜合征性耳聾為主，約占遺傳性耳聾的70%。隨著研究的深入，遺傳性耳聾致聾位點(diǎn)被不斷發(fā)現(xiàn)。GJB2基因目前研究比較透徹，235位點(diǎn)和299位點(diǎn)突變?cè)谌巳褐袛y帶率較高[13]。高加索人群中，50%遺傳性耳聾與GJB2基因有關(guān)[14]。SLC26A4基因與陰離子運(yùn)輸相關(guān)。SLC26A4基因突變發(fā)病相對(duì)較晚，是我國(guó)比較常見的導(dǎo)致功能性耳聾的基因，約占耳聾的5%~10%[15]。線粒體基因突變呈母系遺傳，屬于觸發(fā)式耳聾，正常情況下患者聽力正常，服用氨基糖苷類抗生素時(shí)可導(dǎo)致耳聾。線粒體基因突變約占耳聾人群的1%。

GJB2基因位于13號(hào)染色體上[16]，由兩個(gè)外顯子組成，但只有2號(hào)外顯子參與蛋白編碼，其編碼產(chǎn)物是縫隙連接蛋白，由266個(gè)氨基酸分子組成，廣泛分布于內(nèi)耳螺旋韌帶、基底膜等部位，在毛細(xì)胞鉀離子回流過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]。本組新生兒GJB2基因突變頻率為2.36%，與海寧市新生兒篩查結(jié)果相似[18]。GJB2基因中235delC突變頻率最高，與國(guó)內(nèi)的同類報(bào)道相符[8-9,19]。本次篩查中發(fā)現(xiàn)1例GJB2 35delG雜合突變，此位點(diǎn)在中國(guó)人群中突變率很低，歐美人群突變攜帶率較高[20-21]。發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)突變，可能與外來(lái)人口增加有關(guān)。

表1 新生兒耳聾基因篩查結(jié)果(n)

SLC26A4基因位于7號(hào)染色體，一般以常染色體隱性遺傳，編碼pendrin跨膜蛋白，主要在甲狀腺和內(nèi)耳表達(dá)[22]。SLC26A4基因以IVS7-2位點(diǎn)突變率最高[23]。該基因突變引起陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，導(dǎo)致先天性耳聾和遲發(fā)性耳聾。遲發(fā)性耳聾新生兒聽力篩查通常正常，很容易漏檢。對(duì)于SLC26A4基因突變攜帶者要避免顱壓增大和使用耳毒性藥物，減少致聾發(fā)生。

本次篩查中檢測(cè)到5例12S rRNA 1555位點(diǎn)突變，未發(fā)現(xiàn)1494位點(diǎn)突變，與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果相符[8-9,24]。根據(jù)母系遺傳的特點(diǎn)，可從家庭遺傳系譜推測(cè)其他成員的突變情況，減少致聾發(fā)生。值得注意的是，雖然線粒體12S rRNA屬于母系遺傳，但父親也可將線粒體12S rRNA傳給后代，概率約為1/5000[25]。因此，如果孩子發(fā)現(xiàn)有線粒體12S rRNA突變，而母親沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變，則應(yīng)考慮對(duì)孩子父親進(jìn)行檢測(cè)，確定突變來(lái)源。

GJB3基因位于1號(hào)染色體，屬常染色體顯性或隱性遺傳[26]。該基因突變可導(dǎo)致高頻聽力損失或后天性耳聾。本次篩查檢測(cè)出5例GJB3基因538位點(diǎn)雜合突變。對(duì)GJB3基因538位點(diǎn)突變攜帶者，建議其每半年行聽力測(cè)試1次，時(shí)刻關(guān)注聽力情況，做到早發(fā)現(xiàn)早治療。

十五項(xiàng)遺傳性耳聾篩查相對(duì)于九項(xiàng)遺傳性篩查增加了SLC26A4基因中6個(gè)中國(guó)人群突變頻率相對(duì)較高的位點(diǎn)，分別是1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、IVS15+5G>A，可減少遺傳性耳聾漏篩的風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)1174A>T、1229C>T和15+5G>A的雜合突變各1例，相對(duì)于九項(xiàng)耳聾篩查增加了突變檢出率1.2個(gè)百分點(diǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，遺傳性耳聾的篩查位點(diǎn)會(huì)逐漸增多，漏篩率會(huì)大大降低。

總之，本研究采用十五項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒，對(duì)2545例新生兒GJB2、SLC26A4、12S rRNA和GJB3基因常見致聾位點(diǎn)進(jìn)行篩查和結(jié)果統(tǒng)計(jì)，初步獲得區(qū)域內(nèi)遺傳性耳聾基因突變頻率和突變譜。開展遺傳性耳聾基因篩查不僅能為突變患者提供專業(yè)的治療和婚育指導(dǎo)，而且能有針對(duì)性地提示區(qū)域內(nèi)耳聾基因防控重點(diǎn)，還可以進(jìn)一步構(gòu)建耳聾發(fā)病模型，預(yù)估區(qū)域內(nèi)每年發(fā)病人數(shù)，為醫(yī)院和社會(huì)救助提供數(shù)據(jù)支持。