魏蔚 楊淑改

（1 新鄉(xiāng)醫(yī)學院 河南 新鄉(xiāng) 453000）

（2 平頂山學院 河南 平頂山 467000）

隨轉錄組測序技術的發(fā)展，大多數(shù)惡性腫瘤基因組DNA表現(xiàn)為缺乏蛋白質編碼能力，從而導致加工轉錄過程更明確。長鏈非編碼RNA是最近發(fā)現(xiàn)的一類主要類型的非編碼RNA，其長度超過200個核苷酸[1]。近年來，不斷有新出現(xiàn)的證據(jù)表明，一些lncRNA如PVT1在調(diào)節(jié)基因表達和調(diào)控基因表達方面發(fā)揮重要作用。通過表觀遺傳調(diào)控的生物學功能，包括甲基化，乙?；头核鼗认嚓P作用[2]。

PVT1位于12q14.1上的基因位點，長度為1567nt，已被發(fā)現(xiàn)在多種人類惡性腫瘤中存在過表達情況。在非小細胞肺癌（NSCLC）中，PVT1的表達增加通過與表觀遺傳蛋白相互作用調(diào)節(jié)下游靶標的轉錄[3]。轉化生長因子β（TGF-β）被定義為致癌蛋白，可以一定程度上促進腫瘤生長和轉移，使其成為惡性腫瘤的預后和治療靶點。此前，證明TGF-β在肝細胞癌中通過H3K27修飾進行表觀遺傳學調(diào)節(jié)[4]。然而，PVT1在結腸癌中與TGF-β的相互作用不甚清楚。

本實驗通過假設lncRNA PVT1通過TGF-β通路蛋白表達影響結腸癌細胞的生物學行為。為了驗證這一假設，首先明確PVT1在結腸癌組織和細胞系中的表達水平。通過進行體外和體內(nèi)實驗測定，進一步研究了PVT1在結腸癌的生物學功能相關性

1.材料和方法

1.1 細胞株及相關材料

人結腸癌細胞株HT-29，SW 480，SW620及RKO購買于上海中科院，RPMI-1640培養(yǎng)基和胰酶購買于美國Gibco公司；胎牛血清和雙抗購買于美國?？寺」?；PBS磷酸鹽緩沖液購買于美國Gibco公司。

1.2 組織樣品

結腸癌組織收集2018年1月—8月經(jīng)病理檢查確診為結腸癌組織50例。腫瘤組織離體后，去除血跡，放入4%多聚甲醛中固定。

1.3 miRNA提取和qPCR試驗

使用來自TRIzol試劑按照制造商的說明分離來自組織或細胞系的miRNA。根據(jù)制造商的說明，分別使用miRNA逆轉錄試劑盒和PrimeScirpt RT試劑盒進行逆轉錄。使用SYBR Premix進行定量實時PCR（qRT-PCR）。U6內(nèi)參用作標準化對照。通過2-△△Ct法計算miRNA的相對表達水平。實驗重復3次。本研究中使用的引物如下：PVT1序列F：5'-AGGCTGGGATGGCGAGGGGCA-3'，R：5'-TTGAGCGGCGAGGGAGGGCTAG-3';U6：5'-TAGGCGGATGCGGGCGGATC-3'，R：5'-GATCTATTTCGAGCGATGGA-3'。

1.4 MTT增殖實驗

通過比色MTT增殖能力測定。將實驗組和對照組的結腸癌細胞以初始密度為2×104細胞/孔接種到96孔板中。24小時后，48小時及72小時后，然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入150μl二甲基亞砜，在室溫下攪拌10min保證晶體充分溶解。然后在96h進行MTT測定波長為490nm時的吸光度，計算結腸癌細胞的增殖情況。實驗重復3次。

1.5 Transwell侵襲試驗

使用孔徑為8μm的Transwell室進行細胞遷移和侵襲檢測。 用si-PVT1或NC轉染36小時后，將無血清DMEM培養(yǎng)基中的細胞懸浮液（5×104細胞）置于上室中，其預先涂有Matrigel（用于侵襲測定）。將包含10%FBS的培養(yǎng)基加入下室作為化學引誘物。將細胞在37℃下孵育24小時，然后用棉簽除去上室上的剩余細胞。下室表面上的入侵或遷移的細胞用100%甲醇固定，用0.5%結晶紫染色。在倒置顯微鏡下，從每個室中隨機選擇的5個視野中觀察并計數(shù)侵襲細胞的數(shù)量。實驗重復3次。

1.6 蛋白質印跡

在干預處理后收獲接種在6孔板中的細胞，并使用RIPA裂解緩沖液提取細胞蛋白質。根據(jù)制造商的方案進行蛋白質印跡分析。通過使用BCA試劑盒定量蛋白質濃度。將每個樣品的40±20μg蛋白質進行10%SDS-PAGE并轉移到PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的Tris基生理鹽水-吐溫20（TBST）室溫封閉膜1小時。TGF-β（1∶1000）、Smad2（1∶1000）和α-SMA（1∶1000）和GAPDH（1∶2000）與膜在4℃溫育過夜。用TBST洗滌三次后，將二抗（1∶2000）針對相關的一級抗體在室溫下與膜孵育2小時。使用電化學發(fā)光（ECL）使蛋白顯影。

1.7 統(tǒng)計學分析

本實驗所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用軟件DPS v9.50進行處理，計量資料用均數(shù)±標準差表示，t檢驗。P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 PVT1在結腸癌組織和細胞株中的表達情況。

qPCR結果表明：（圖1A）與矮胖正常組織相比，結腸癌組織中PVT1 mRNA表達水平較高[（1.28±0.18）vs （2.78±0.12），P＜0.05]；與其他細胞株相比（圖1B），HCT8和SW620細胞中PVT1 mRNA表達水平較高[（3.58±0.18）vs（3.05±0.28），P＜0.05]，差異有統(tǒng)計學意義；PVT1在HCT8和SW620細胞株中表達水平比其他結腸癌細胞株較高，考慮PVT1在結腸癌中可能扮演起促癌作用。

圖1 （A）結腸癌組織和癌旁正常組織中PVT1的表達水平。（B）不同類型結腸癌細胞株中PVT1的表達水平。*P＜0.05。

2.2 PVT1與結腸癌患者的臨床病理參數(shù)之間的關系

本實驗把50例結腸癌腫瘤組織樣本和癌旁正常組織進行統(tǒng)計分析。在不同性別和年齡段的結腸癌患者之間PVT1的表達水平差異不明顯，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05；表1）。隨著結腸癌分期越高，結腸癌患者組織中的PVT1的表達水平越明顯，存在結腸癌淋巴結轉移的患者組織中PVT1的表達越明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；表1）。

表1 結腸癌患者組織中PVT1的表達與其臨床病理特征之間的關系

2.3 PVT1對結腸癌細胞增殖能力的影響

圖1A示，慢病毒轉染HCT8和SW620結腸癌細胞株后，PVT1的表達水平相對降低。MTT增殖實驗結果顯示（圖2B，C），PVT1-siRNA實驗組的細胞增殖速率低于Vector對照組的細胞增殖速率[（1.28±0.59）vs（0.73±0.28），P＜0.05]，兩組的差異具有統(tǒng)計學意義。

圖2.（A）慢病毒轉染HCT8和SW620結腸癌細胞株。（B，C）MTT增殖實驗檢測PVT1對結腸癌細胞增殖能力的影響。*P＜0.05

2.4 PVT1對結腸癌細胞侵襲行為的影響

Transwell侵襲結果顯示(圖4A)：HCT8結腸癌細胞組si-PVT1組通過Matrigel基質膠的細胞數(shù)量為181.52±13.24，多于NC組72.54±8.12，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SW620結腸癌細胞組si-PVT1組通過Matrigel基質膠的細胞數(shù)量為195.92±12.75，多于NC組62.5±7.17，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 PVT1對結腸癌HCT8和SW620細胞侵襲能力的影響。*P＜0.05

2.5 PVT1對TGF-β信號通路激活的影響。

Western blotting免疫印跡法檢測PVT1對TGF-β信號通路蛋白的表達的情況。結果顯示（圖4A，B）：在HCT8和SW620細胞株中，在si-PVT1組中TGF-β、Smad2和α-SMA蛋白的表達水平相比Vector對照組顯著降低[TGF-β（1.19±0.15）% vs（0.19±0.05）%，P＜0.05；Smad2（1.35±0.18）% vs（0.28±0.08）%，P＜0.05；Smad2（1.38±0.16）% vs（0.26±0.07）%，P＜0.05]。結果表明，抑制PVT1后，TGF-β信號通路的相關蛋白的水平受到一定的抑制，表明PVT1可以通過調(diào)控TGF-β信號通路的激活，影響結腸癌細胞的相關生物學行為。

圖4 PVT1對TGF-β信號通路激活的影響

3.討論

過去腫瘤研究的方向是通過研究分子的化學抗性和細胞作用機制，這是治療晚期癌癥類型失敗的主要原因之一。然而，自21世紀以來，關于各種蛋白分子的相關進展甚微。因此，新型分子特征的發(fā)現(xiàn)似乎在腫瘤表征中具有很大的前景，并且可以用作潛在的治療靶標。為了確定lncRNA是治療惡性腫瘤潛在分子生物標志物及與下游相關蛋白通路的功能相關性，本研究結果針對PVT1通過與TGF-β結合并激活信號通路的活性表達，從而調(diào)節(jié)腫瘤生長及細胞生長行為。

研究表明基因過度擴增和PVT1的陽性診斷率有直接的關聯(lián)，可以導致惡性腫瘤的預后結果較差。盡管目前診斷l(xiāng)ncRNA的靶向治療仍然是臨床輔助治療，不算做標準治療方案，但對化療藥物獲得性耐藥的存在是一個嚴重的問題，通過對抵抗機制的研究理解可能有助于克服臨床化療耐藥抵抗的難題。

LncRNA PVT1最近被證實是非小細胞肺癌和胃癌中的致癌基因，但未報道在結腸癌中的表達。在這項研究中確定了PVT1的表達水平，并研究了其在結腸癌中的功能作用。與先前的報道一致，本實驗結果顯示PVT11在結腸癌中表達上調(diào)并促進腫瘤生長活性。本實驗通過研究下游蛋白通路靶點的激活情況，推測PVT1通過介導TGFβ參與結腸癌的侵襲和遷移過程，從而促進腫瘤增殖，抑制細胞凋亡和發(fā)展，可以參照這一分子特性，進一步探討PVT1分子在臨床化療治療過程的參與機制。Shi等學者研究報道抑制TGF-β通路蛋白的活性可以有效減少乳腺癌小鼠模型的肺轉移，并降低CCL5蛋白的表達。通過本實驗研究推測，TGF-β被PVT1調(diào)控后可能對PVT1功能有一定反向影響，表明PVT1通過靶向TGF-β調(diào)節(jié)結腸癌細胞生物學活性有一定的實驗推論。

最近相關證據(jù)表明，lncRNAs可以作為染色質修飾復合物的支架，并作為響應DNA損傷的信號，表明lncRNAs的調(diào)節(jié)功能依賴于其相互作用的蛋白質。TGF-β是具有組蛋白乙酰轉移酶活性的轉錄共激活因子，其被證明對組蛋白乙?；苤匾?。最近，據(jù)報道lncRNA的部分亞型與TGF-β結合，通過修飾組蛋白乙?；瘉碛绊懟虮磉_。在本研究中，我們驗證了PVT1可以調(diào)控TGF-β的表達，進一步激活TGF-β信號通路。最后，我們將進一步探討了PVT1在結腸癌患者中的潛在轉化應用。