徐富增，王柯，李善元，毛忠貴，張建華*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(云南保山九隆酵母有限公司，云南 保山，678000)

酵母及其副產(chǎn)品可廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)，有著廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)和良好的經(jīng)濟(jì)效益。2016年全球酵母產(chǎn)品市場(chǎng)達(dá)到近71億美元，預(yù)計(jì)到2022年將達(dá)到107億美元[1]。酵母生產(chǎn)原材料的廉價(jià)易得是酵母產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)效益好的一個(gè)原因。糖蜜作為制糖加工的副產(chǎn)物，是最廉價(jià)的碳水化合物之一，含有大約50%的糖類，以及一些含氮物質(zhì)、維生素和微量元素，是用于酵母培養(yǎng)的主要原料[2-4]。

在酵母培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的Crabtree效應(yīng)[5]是制約酵母生長(zhǎng)的一個(gè)因素，該效應(yīng)指當(dāng)可發(fā)酵性碳源濃度過(guò)高時(shí)，即使供氧充足，也會(huì)導(dǎo)致碳源流向乙醇合成途徑，導(dǎo)致乙醇積累，使得糖利用率下降。而且，高濃度的乙醇副產(chǎn)物也會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能造成損傷，抑制菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成[6]。因此，酵母培養(yǎng)難點(diǎn)主要在于如何有效控制糖濃度，在保證酵母正常生長(zhǎng)的同時(shí)減小溢流代謝，提高原料利用率，實(shí)現(xiàn)酵母的高得率、高濃度生長(zhǎng)[7]。

高密度培養(yǎng)是酵母工業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)，實(shí)現(xiàn)高密度、高產(chǎn)率和高濃度培養(yǎng)是酵母工業(yè)的目標(biāo)和方向[8-9]。在補(bǔ)料分批過(guò)程中可以通過(guò)補(bǔ)料策略的優(yōu)化，控制培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)的流入，實(shí)現(xiàn)生物量和得率最大化。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，補(bǔ)料策略逐漸變得復(fù)雜化，引入一些更為復(fù)雜的數(shù)學(xué)模型及人工智能技術(shù)。

張?jiān)S等[10]將差分進(jìn)化算法(differential evolution，DE)與傳統(tǒng)比例-積分-微分(proportional-integral-derivative，PID)控制策略相結(jié)合，構(gòu)建了用于釀酒酵母分批補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程的在線自適應(yīng)控制策略，成功將乙醇穩(wěn)定地控制在設(shè)定值(1 g/L)附近，同時(shí)使得酵母增殖質(zhì)量濃度達(dá)到34.45 g/L。CHOPDA等[11]采用基于TCP/IP協(xié)議的解耦輸入-輸出線性化控制器(decoupled input-output linearizing controller，DIOLC)實(shí)時(shí)在線控制溶氧和殘余葡萄糖，實(shí)現(xiàn)酵母生長(zhǎng)最大化，與PID或PID-控制器相比，可提高23%和18%的菌體量。HOCALAR等[12]基于狀態(tài)估計(jì)算法構(gòu)建了狀態(tài)反饋線性控制策略，通過(guò)在控制算法中設(shè)定菌體濃度和乙醇濃度，通過(guò)調(diào)節(jié)最小乙醇濃度來(lái)控制比生長(zhǎng)速率，調(diào)整流加策略，成功實(shí)時(shí)控制乙醇濃度，以使生物質(zhì)生產(chǎn)率最大化。但是，對(duì)于多數(shù)中小型酵母生產(chǎn)企業(yè)來(lái)講，這些方法并不適用，因?yàn)橄冗M(jìn)的方法往往涉及復(fù)雜的控制設(shè)備和實(shí)施復(fù)雜控制算法，需要必要的輔助設(shè)備，這些額外且昂貴的經(jīng)濟(jì)投入是大多數(shù)中小型企業(yè)現(xiàn)代化道路上的一個(gè)嚴(yán)重障礙[13]。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單、低成本的方法進(jìn)行釀酒酵母培養(yǎng)，更適用于小企業(yè)的需要。

本文以實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的糖蜜培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以菌體量、菌體得率和生產(chǎn)強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究了DO-Stat和擬指數(shù)2種常規(guī)補(bǔ)料策略，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了“擬指數(shù)—DO-Stat”兩階段補(bǔ)料策略，該策略可以盡可能解除Crabtree效應(yīng)，避免溢流代謝，提高酵母菌體得率和生產(chǎn)強(qiáng)度，提高設(shè)備利用率，為酵母工業(yè)高密度培養(yǎng)工藝的開發(fā)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，由云南保山九隆酵母有限公司提供。于斜面保藏培養(yǎng)基4 ℃保藏。

1.2 培養(yǎng)基

(1)種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖22.0，酵母抽提物8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，無(wú)水CaCl20.06，pH自然，115 ℃滅菌15 min。

(2)斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖22.0，酵母提取物8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，無(wú)水CaCl20.06，瓊脂2.0。pH自然，115 ℃滅菌15 min。

(3)上罐培養(yǎng)基(g/L)：糖蜜稀釋液總糖79.0，(NH4)2SO48.56，KH2PO41.85，MnCl2·4H2O 0.003，ZnSO4·7H2O 0.007 5。

(4)補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：糖蜜稀釋液總糖350，(NH4)2SO438，KH2PO48.16。培養(yǎng)基為保證碳源總量一致，均按總糖計(jì)稱取相應(yīng)質(zhì)量的糖蜜。

1.3 試劑與材料

葡萄糖、NH4Cl、MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O等(分析純)，上海國(guó)藥集團(tuán)；酵母抽提物(分析純)，英國(guó)Oxoid公司；甜菜糖蜜，云南保山九隆酵母有限公司，經(jīng)稀釋后配料使用，主要成分如表1所示。

表1 糖蜜主要成分 單位：%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

1.4 儀器與設(shè)備

5 L二聯(lián)發(fā)酵罐(BLBIO-5GJ-2)，上海百倫生物設(shè)備有限公司；高效液相(U-3000)，USA Dionex；立式壓力蒸汽滅菌器(LS-B50L)，上?；瘜W(xué)醫(yī)用核子儀器公司；分析天平(AB204-N)，瑞士梅特勒公司；真空干燥箱(DZF-6050)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；回轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床(HYG-Ⅱ)，上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；電子天平(BS1100+)，上海友聲衡器有限公司；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.5 種子培養(yǎng)

從斜面培養(yǎng)基中挑取1～2環(huán)酵母菌，接種于種子培養(yǎng)基，500 mL三角瓶裝液量為200 mL，于200 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)16～17 h，至酵母數(shù)為3×108～4×108個(gè)/mL。

1.6 酵母培養(yǎng)方式

酵母高密度培養(yǎng)采取先分批后流加的方式。先將種子培養(yǎng)基按體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量接種于上罐培養(yǎng)基，待可發(fā)酵性糖和乙醇消耗完畢，溶氧(dissolved oxygen，DO)上升開始流加。本文所探究的補(bǔ)料方式共有3種，分別為擬指數(shù)補(bǔ)料、DO-Stat補(bǔ)料、兩階段補(bǔ)料。不同的補(bǔ)料方式均流加相同的體積。

(1)分批培養(yǎng)：在5 L機(jī)械攪拌式通風(fēng)發(fā)酵罐中裝入2.7 L上罐培養(yǎng)基，接入300 mL種子培養(yǎng)基。調(diào)整通氣量為5.0 L/min，初始轉(zhuǎn)速400 r/min。在酵母達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的3～4 h之后，將轉(zhuǎn)速調(diào)整到600 r/min。利用2 mol/L的H2SO4和2 mol/L的NaOH維持pH值為5.5，溫度30 ℃，食品消泡劑控制泡沫產(chǎn)生。

(2)擬指數(shù)補(bǔ)料：采用上罐培養(yǎng)基進(jìn)行分批培養(yǎng)，在21 h左右溶氧上升，即可發(fā)酵性糖和乙醇消耗完畢后，開啟補(bǔ)料泵，按照預(yù)設(shè)的補(bǔ)料速率將補(bǔ)料培養(yǎng)基流加入罐內(nèi)。開始補(bǔ)料后，調(diào)整通氣流量為7.0 L/min，轉(zhuǎn)速600～900 r/min，溶氧關(guān)聯(lián)攪拌控制DO不低于30%。pH值、溫度、泡沫控制與分批培養(yǎng)相同。

補(bǔ)料速率按公式(1)[14]計(jì)算：

(1)

其中：F，補(bǔ)料速率，L/h；μ，所設(shè)定的酵母比生長(zhǎng)速率，h-1；V0，補(bǔ)料開始罐內(nèi)培養(yǎng)基體積，L；ρC0，開始補(bǔ)料時(shí)罐內(nèi)菌體質(zhì)量濃度，g/L；YX/S，菌體得率，%；ρSF，補(bǔ)料培養(yǎng)基的總糖質(zhì)量濃度，g/L；ρS，開始補(bǔ)料時(shí)段的罐內(nèi)總糖質(zhì)量濃度，g/L；t，指數(shù)補(bǔ)料時(shí)間，h。

補(bǔ)料方式[15]：采用脈沖型蠕動(dòng)泵補(bǔ)料，但難以實(shí)現(xiàn)隨時(shí)間的精確變化的補(bǔ)料速度。因此，采用時(shí)間差分法進(jìn)行補(bǔ)料速率的計(jì)算和控制。設(shè)定每2 h更改補(bǔ)料速率，即以補(bǔ)料開始時(shí)間t時(shí)刻更改補(bǔ)料速率，該速率在t～t+2時(shí)間段持續(xù)，根據(jù)公式計(jì)算該2 h內(nèi)的平均補(bǔ)料速度，計(jì)算t值取中間時(shí)刻t+1。

以μ=0.02 h-1為例，補(bǔ)料速率的計(jì)算值和操作值如圖1所示。

圖1 擬指數(shù)補(bǔ)料的理論流速與實(shí)際操作流速

Fig.1 The theoretical feeding rate and the actual set valueof the quasi-exponential

(3)DO-Stat補(bǔ)料：在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，當(dāng)溶氧開始上升后，啟動(dòng)DO-Stat機(jī)制進(jìn)行補(bǔ)料。當(dāng)溶氧高于設(shè)定值時(shí)，通過(guò)反饋機(jī)制開啟蠕動(dòng)泵加入培養(yǎng)基，溶氧低于設(shè)定值時(shí)，通過(guò)在線自動(dòng)控制提高轉(zhuǎn)速，在該過(guò)程中將通氣調(diào)整在7.0 L/min。pH值、溫度、泡沫控制與分批培養(yǎng)相同。

(4)兩階段補(bǔ)料：采用上罐培養(yǎng)基進(jìn)行分批培養(yǎng)，在21 h左右溶氧上升，按照擬指數(shù)補(bǔ)料方式進(jìn)行補(bǔ)料，在48 h左右溶氧跌到20%以下并有乙醇產(chǎn)生時(shí)，調(diào)整為DO 40%的DO-stat補(bǔ)料。

1.7 分析方法

總糖測(cè)定:斐林試劑滴定法[16]。

乙醇測(cè)定：HPLC法[17]。發(fā)酵液在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液進(jìn)行0.22 μm膜過(guò)濾處理，濾液進(jìn)行HPLC(Dionex，USA)測(cè)定。液相色譜條件：Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8mm，9 μm，Hercules，CA)；RI檢測(cè)器(Shodex RI-101，Japan)和UV檢測(cè)器(Dionex，USA)；流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4；柱溫65 ℃；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

菌體干重(dry cell weight，DCW)：取發(fā)酵液置于烘干至恒重的離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用去離子水反復(fù)洗滌離心菌體3～4次。于真空干燥箱中干燥至恒重。稱量計(jì)算菌體干重。

菌體得率：生成菌體與所消耗糖的質(zhì)量比值。按公式(2)計(jì)算：

(2)

其中：YX/S，菌體得率，%；X，總的菌體干重，g；S，總的糖消耗質(zhì)量，g。

生產(chǎn)強(qiáng)度：?jiǎn)挝惑w積反應(yīng)器的生產(chǎn)能力。計(jì)算采用公式(3)：

(3)

其中：P，生產(chǎn)強(qiáng)度，g/(L·h)；ρ，菌體質(zhì)量濃度，g/L；T，培養(yǎng)時(shí)間，h。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始糖濃度優(yōu)化

將底物濃度定為上罐培養(yǎng)基的1.5倍和2.0倍進(jìn)行分批培養(yǎng)與初始上罐培養(yǎng)基結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示，隨著培養(yǎng)基濃度的提高，菌體量?jī)H有小幅提升，但是生長(zhǎng)周期和最大乙醇產(chǎn)量卻大大增加。說(shuō)明培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增加到一定濃度時(shí)，菌體生長(zhǎng)顯示飽和動(dòng)力學(xué)，底物濃度的進(jìn)一步增加引起底物抑制，使得遲滯期延長(zhǎng)[18]；而且過(guò)量的碳源引起Crabtree效應(yīng)，使得糖代謝從TCA循環(huán)轉(zhuǎn)至乙醇合成途徑，導(dǎo)致大量乙醇的產(chǎn)生，抑制了細(xì)胞密度的進(jìn)一步提高[19]。因此，分批培養(yǎng)難以實(shí)現(xiàn)高密度的水平，要提高細(xì)胞密度，需采用補(bǔ)料培養(yǎng)的方式。

表2 不同底物質(zhì)量濃度下酵母生長(zhǎng)參數(shù)比較

注：a-以標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD) 表示；b、c，分別為1.5倍、2.0倍培養(yǎng)基濃度中初總糖濃度；其中培養(yǎng)基各成分均以上罐培養(yǎng)基為基礎(chǔ)按照倍數(shù)增加。

2.2 擬指數(shù)補(bǔ)料條件下酵母的生長(zhǎng)特性

擬指數(shù)補(bǔ)料是一種根據(jù)菌體生長(zhǎng)規(guī)律制定補(bǔ)料速率的方法，理論上可以使菌體在最佳狀態(tài)下生長(zhǎng)[20]，因此本文采用控制比生長(zhǎng)速率的擬指數(shù)補(bǔ)料。開始補(bǔ)料的初始條件以分批結(jié)束時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)為準(zhǔn)，初始體積為3.0 L、菌體質(zhì)量濃度為32 g/L、補(bǔ)料開始糖質(zhì)量濃度為10.0 g/L。分別在比生長(zhǎng)速率為0.02、0.03、0.04 h-1條件下考察補(bǔ)料效果(圖2)。

結(jié)果如圖2所示，隨著比生長(zhǎng)速率的提高，酵母的生長(zhǎng)周期明顯縮短。但是在不同的比生長(zhǎng)速率控制條件下，后期均有乙醇出現(xiàn)，乙醇的出現(xiàn)均與溶氧的下降同時(shí)發(fā)生，μ為0.02、0.03、0.04 h-1分別在60、48、42 h溶氧降到20%以下甚至更低。該現(xiàn)象應(yīng)該是由于菌體濃度較大，有限的通風(fēng)攪拌供氧已經(jīng)難以維持酵母的有氧呼吸，造成Crabtree效應(yīng)，此時(shí)酵母的生長(zhǎng)速率已經(jīng)難以維持在設(shè)定值[15,19]。

A-μ=0.02 h-1；B-μ=0.03 h-1；C-μ=0.04 h-1圖2 擬指數(shù)補(bǔ)料流加培養(yǎng)過(guò)程圖

Fig.2 The culture process with quasi-exponential feeding at specific growth rate

從表3可以看出，乙醇溢流代謝的出現(xiàn)導(dǎo)致糖的利用率下降，最大的菌體量出現(xiàn)在μ為0.02 h-1時(shí)，也僅有100.5 g/L，說(shuō)明單一的擬指數(shù)補(bǔ)料并不適合于釀酒酵母的高密度培養(yǎng)。但是本研究發(fā)現(xiàn)，在TE時(shí)刻之前，并沒有導(dǎo)致糖的累積和乙醇的出現(xiàn)，該階段酵母的生產(chǎn)強(qiáng)度較高，μ為0.02、0.03、0.04 h-1分別達(dá)到1.03、1.55、1.61 g/(L·h)，高于全過(guò)程的生產(chǎn)強(qiáng)度。而在TE之后，由于糖的流加速率大于酵母的消耗速率才使得糖累積、Crabtree效應(yīng)出現(xiàn)。因此，在溶氧下降之后可以適當(dāng)降低流加速率，避免該現(xiàn)象的發(fā)生?？紤]到操作的易行性，可以采取后期進(jìn)行DO-stat流加。本文選擇μ為0.03 h-1是比較適合的。因?yàn)樵?～TE，相比于μ為0.04 h-1的補(bǔ)料，μ為0.03 h-1的生產(chǎn)強(qiáng)度僅低了3.8%；TE時(shí)刻流加培養(yǎng)基的體積為0.82 L，低于μ為0.04 h-1的1.14 L，但此時(shí)DCWE卻高出2.9%，說(shuō)明在TE時(shí)刻之前,菌體生長(zhǎng)已經(jīng)不能遵循預(yù)設(shè)的0.04 h-1的比生長(zhǎng)速率，一部分糖已經(jīng)出現(xiàn)累積，這在圖3中也可以看出。

2.3 DO-Stat補(bǔ)料條件下酵母的生長(zhǎng)特性

酵母的高密度培養(yǎng)制約因素主要來(lái)自于兩個(gè)方面[14]：一是供氧不足導(dǎo)致酵母發(fā)生厭氧代謝生成乙醇；二是當(dāng)培養(yǎng)基中的糖濃度較高時(shí)產(chǎn)生Crabtree效應(yīng)，糖溢流代謝生成乙醇。兩者均會(huì)影響糖的轉(zhuǎn)化率。所以，對(duì)于酵母的培養(yǎng)應(yīng)當(dāng)從控制溶氧和控制糖濃兩方面入手。由于無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵罐內(nèi)糖的濃度，而離線檢測(cè)存在一定的滯后性，容易造成糖的累積或缺乏，目前難以通過(guò)糖濃度控制補(bǔ)料速率。

表3 擬指數(shù)補(bǔ)料中不同比生長(zhǎng)速率酵母生長(zhǎng)參數(shù)比較

注:TE指乙醇出現(xiàn)時(shí)的時(shí)間；DCWE指乙醇出現(xiàn)時(shí)刻DCW。下同。

溶氧是反映菌體生長(zhǎng)的一個(gè)指標(biāo)，當(dāng)糖足夠且菌體生長(zhǎng)旺盛時(shí)，表現(xiàn)溶氧下降；糖濃不足時(shí)，菌體會(huì)由于饑餓死亡，表現(xiàn)為溶氧上升。所以考慮采用DO-stat的手段進(jìn)行反饋流加，使得溶氧維持在一定水平，既不因?yàn)槿苎醪蛔慊蛱菨膺^(guò)高產(chǎn)生乙醇溢流代謝，也不會(huì)出現(xiàn)供糖不足造成的菌體死亡的現(xiàn)象[21-23]。

在21 h可發(fā)酵性糖及乙醇消耗完畢后，在10 min內(nèi)溶氧急劇上升至超過(guò)設(shè)定溶氧值10%以上，啟動(dòng)溶氧反饋流加。分別將溶氧設(shè)定為30%、40%、50%對(duì)酵母進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)。從圖3中可以看出，溶氧的設(shè)定對(duì)酵母的生長(zhǎng)有較大的影響，隨著設(shè)定溶氧值的升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速上升到一定高度時(shí)，為了維持較高溶氧，培養(yǎng)基的流加速率逐漸降低，使得體系中糖無(wú)法累積甚至溶氧過(guò)高時(shí)，菌體出現(xiàn)饑餓狀態(tài)，導(dǎo)致酵母生長(zhǎng)減緩，發(fā)酵周期延長(zhǎng)。當(dāng)設(shè)定溶氧值較低時(shí)，為了匹配較低溶氧，糖的流加速率加快，使得酵母快速生長(zhǎng)繁殖，溶氧保持在較低水平，但是由于溶氧的降低以及糖的積累使得更多的糖流向乙醇代謝，對(duì)酵母生長(zhǎng)造成不利，影響原料利用。

A-30% DO；B-40% DO；C-DO 50%圖3 DO-stat補(bǔ)料流加培養(yǎng)過(guò)程圖

Fig.3 The culture process with DO-stat feeding at dissolved oxygen concentrations

因此，一個(gè)合適的溶氧水平對(duì)酵母的流加培養(yǎng)是至關(guān)重要的。從表4可以看出，DO為40%時(shí)的DCW、菌體得率是最高的,且各條件下均未發(fā)現(xiàn)明顯的乙醇累積，說(shuō)明合適的DO-stat可以有效達(dá)到高密度水平，抑制Crabtree效應(yīng)。但是較長(zhǎng)的培養(yǎng)周期嚴(yán)重影響了菌體的生產(chǎn)強(qiáng)度，即使在最優(yōu)的DO40%時(shí)，生產(chǎn)強(qiáng)度也只有1.004 g/(L·h)。

合適的DO-stat雖然能夠得到比較高的菌體濃度，但是其生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，降低了體積生產(chǎn)率。對(duì)于企業(yè)生產(chǎn)尤其是比較廉價(jià)的酵母來(lái)講，生產(chǎn)效率也是決定產(chǎn)業(yè)利益的一個(gè)重要因素。因此，如何在保證較高菌體濃度的前提下，提高生產(chǎn)強(qiáng)度是提高酵母生產(chǎn)能力的關(guān)鍵。

表4 DO-stat補(bǔ)料中不同溶氧水平酵母生長(zhǎng)參數(shù)比較

2.4 擬指數(shù)結(jié)合DO-stat的兩階段補(bǔ)料條件下酵母的生長(zhǎng)特性

基于擬指數(shù)和DO-stat各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此將二者進(jìn)行結(jié)合，首先在糖和乙醇消耗完畢之后進(jìn)行μ為0.03 h-1的擬指數(shù)補(bǔ)料，在擬指數(shù)補(bǔ)料的第48 h產(chǎn)生乙醇之前，將補(bǔ)料方式改為溶氧為40%DO-Stat，降低補(bǔ)料速率，減緩生長(zhǎng)，將溶氧控制在合適范圍。結(jié)果如圖4所示。

圖4 擬指數(shù)—DO-stat兩階段補(bǔ)料流加培養(yǎng)過(guò)程圖

Fig.4 The culture process with two-step feeding strategy

從圖4可以看出，兩階段補(bǔ)料可以有效解決指數(shù)補(bǔ)料后期溶氧不足、乙醇積累的問(wèn)題，并且可以提高DO-stat過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)速率。經(jīng)過(guò)108 h的兩階段補(bǔ)料可得到123.57 g/L的菌體、0.51 g/g的總菌體得率和1.15 g/(L·h)的生產(chǎn)強(qiáng)度。相對(duì)于DO-stat培養(yǎng)周期縮短了20.4%，生產(chǎn)強(qiáng)度提高了15%，達(dá)到了預(yù)期的高密度培養(yǎng)的目標(biāo)。

擬指數(shù)補(bǔ)料由于后期溶氧難以維持，實(shí)際比生長(zhǎng)速率低于設(shè)定值造成糖累積，產(chǎn)生乙醇代謝，通過(guò)將乙醇出現(xiàn)之后階段的補(bǔ)料方式調(diào)整為DO-stat補(bǔ)料，可以有效解決該問(wèn)題，因此將補(bǔ)料前期設(shè)定為高速生長(zhǎng)的擬指數(shù)補(bǔ)料，后期切換可避免乙醇代謝的DO-stat補(bǔ)料，可以有效綜合兩種補(bǔ)料的優(yōu)勢(shì)，提高酵母生長(zhǎng)水平。

3 結(jié)論與討論

酵母培養(yǎng)中，如果有乙醇溢流代謝的出現(xiàn)，不可避免的會(huì)造成細(xì)胞濃度的下降。保持釀酒酵母生長(zhǎng)中非常低水平的乙醇，可以有效實(shí)現(xiàn)高濃菌體量，提高糖的轉(zhuǎn)化率。因此，為了在釀酒酵母的培養(yǎng)過(guò)程中獲得高產(chǎn)量的菌體，糖濃度必須滿足兩點(diǎn)：一是足夠滿足酵母生長(zhǎng)需求，二是避免過(guò)量而產(chǎn)生溢流代謝[24-25]。合理的補(bǔ)料方式是提高酵母生長(zhǎng)能力，提高菌體密度的關(guān)鍵。

單一的恒速或指數(shù)補(bǔ)料可以解決分批培養(yǎng)中菌體濃度較低的問(wèn)題，使酵母快速增殖達(dá)到較高菌體濃度，但是Crabtree效應(yīng)難以避免，糖的轉(zhuǎn)化率總是難以保證。例如KIM等[26]使用釀酒酵母JUL3利用50%糖蜜進(jìn)行恒速補(bǔ)料培養(yǎng)80 h后得到95.7 g/L DCW；康遠(yuǎn)軍[27]采用μ為0.05 h-1的指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)魯氏酵母48 h得到72.91 g/L的DCW，菌體得率僅為0.3 g/g。為了解決Crabtree效應(yīng)，有學(xué)者采用在指數(shù)補(bǔ)料后期將比生長(zhǎng)速率降低或者全程保持較高溶氧，這樣可以避免乙醇產(chǎn)生，但是也會(huì)帶來(lái)生產(chǎn)效率較低或菌體濃度較低的問(wèn)題。例如，季萌等[15]使用釀酒酵母AFY-1利用優(yōu)化的線性減少比生長(zhǎng)速率的指數(shù)補(bǔ)料方式，培養(yǎng)102 h后得到77.5 g/L DCW；GAO等[28]對(duì)釀酒酵母采用DO-stat補(bǔ)料培養(yǎng)50 h得到了51.2 g/L的DCW。

總體來(lái)講，傳統(tǒng)的單一補(bǔ)料方式很難進(jìn)行全局調(diào)控，菌體濃度很難高于本研究的兩階段補(bǔ)料。本研究提出了兩階段補(bǔ)料，在前期進(jìn)行擬指數(shù)補(bǔ)料，在后期由于菌體濃度高溶氧難以維持、造成乙醇溢流代謝時(shí)將補(bǔ)料方式切換為DO-stat補(bǔ)料。同時(shí)解決了細(xì)胞增殖緩慢與殘?zhí)抢鄯e、乙醇代謝的問(wèn)題，可有效提高生產(chǎn)強(qiáng)度、提高菌體得率。經(jīng)過(guò)108 h的兩階段補(bǔ)料培養(yǎng)可以得到123.57 g/L的DCW。比分批培養(yǎng)和擬指數(shù)補(bǔ)料分別高了286%和23.8%；菌體得率達(dá)到0.51 g/g，比分批培養(yǎng)和指數(shù)補(bǔ)料分別高了13.3%和6.25%；相比DO-stat補(bǔ)料，生長(zhǎng)周期縮短了20.4%，生產(chǎn)強(qiáng)度提高了14.6%。表明兩階段補(bǔ)料模式可以有效地提高酵母生長(zhǎng)能力，達(dá)到高密度培養(yǎng)水平，在生產(chǎn)上具有明顯的優(yōu)勢(shì)。