牛明明，熊 云，許世海，朱 鵬，孫新楓

(1.陸軍勤務(wù)學(xué)院，重慶 401331；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院)

噴氣燃料在儲存、運(yùn)輸、使用過程中不可避免地會有水分進(jìn)入，燃料添加劑、儲運(yùn)設(shè)施含有氮、磷等微量元素，這就為微生物生長繁殖創(chuàng)造了條件。而周圍環(huán)境中的微生物隨水分、灰塵等物質(zhì)通過呼吸管路進(jìn)入燃料中，引起噴氣燃料微生物污染[1-2]。噴氣燃料中的微生物污染不僅影響燃料的腐蝕性、潔凈性，而且降解燃料的組分和添加劑，影響噴氣燃料的性質(zhì)[2-6]。研究表明[7-10]，枝孢霉菌是噴氣燃料的一種特征真菌，廣泛存在于噴氣燃料中。三磷酸腺苷(ATP)是生物體重要的能量載體，參與細(xì)胞新陳代謝的全過程，在細(xì)胞裂解后被釋放出來。熒光素酶可在ATP和Mg2+存在的環(huán)境下將蟲熒光素氧化成帶電激發(fā)狀態(tài)，而激發(fā)態(tài)分子回到基態(tài)過程中釋放光子[11]。可以通過儀器設(shè)備測定反應(yīng)釋放的微弱光，再根據(jù)光強(qiáng)度推測ATP含量，進(jìn)而計算出樣品中的微生物含量[12-13]。ATP檢測法是國際航空運(yùn)輸協(xié)會推薦的噴氣燃料中微生物含量的檢測方法之一[14]。本研究通過測定不同時間點特征真菌在培養(yǎng)體系水相的發(fā)光強(qiáng)度，繪制枝孢霉菌生長曲線，隨枝孢霉菌生長繁殖，測定燃料總酸值等理化指標(biāo)，考察噴氣燃料性質(zhì)隨枝孢霉菌生長的變化，為判斷燃料污染等級提供依據(jù)。

1 實 驗

1.1 原料及儀器

試驗用油為3號噴氣燃料，取自中國石化鎮(zhèn)海煉化分公司；試驗用真菌為枝孢霉菌，本課題前期培養(yǎng)并鑒定過的真菌，保存于沙保氏平板培養(yǎng)基中；沙保氏液體培養(yǎng)基主要組分為4 g葡萄糖、1 g蛋白胨、100 mL去離子水。

試劑：氫氧化鉀、異丙醇、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、吐溫80、二甲基硅油、葡萄糖，均為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司生產(chǎn)；燦爛綠、酚酞，成都市科隆化學(xué)品有限公司提供；α-萘酚醌苯基甲烷(對萘酚苯)、氯烴基二甲基苯甲胺由上海麥克林生化科技有限公司提供；蛋白胨，由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

儀器：美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)的ECO 1.2超凈工作臺；日本TOMY Digital Biology公司生產(chǎn)的SX-300快速自動高壓滅菌器；鄭州市亞榮儀器有限公司生產(chǎn)的SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵；承德鼎盛試驗機(jī)檢測設(shè)備有限公司生產(chǎn)的JYW-200C全自動表界面張力儀；上海泰邁儀器有限公司生產(chǎn)的SPX-30085-Ⅱ生化培養(yǎng)箱；合肥巔峰生物科技有限公司生產(chǎn)的ATP檢測儀；南京陵武新技術(shù)應(yīng)用開發(fā)研究中心制造的NJ-1A石油產(chǎn)品腐蝕試驗多用儀；天津市賽得利斯實驗分析儀器公司生產(chǎn)的SHA-A水浴恒溫振蕩器；上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司制造的202A-3數(shù)顯電熱恒溫干燥箱；美國Millipore公司生產(chǎn)的Milli-Q純水儀；玻璃砂芯過濾裝置由上海新亞凈化器件廠生產(chǎn)，濾膜0.22 μm。

1.2 試驗方法

1.2.1 構(gòu)建培養(yǎng)體系①用250 mL三角燒瓶配制2組100 mL沙保氏培養(yǎng)液，并在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min；在超凈工作臺中，將在沙保氏平板培養(yǎng)基中保存的菌種分別接種至滅菌后的沙保氏液體培養(yǎng)基中，然后將接種后的沙保氏液體培養(yǎng)基放置在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)3天(轉(zhuǎn)速為180 rmin，溫度為27 ℃)。②將清洗后的1 L試劑瓶及過濾裝置滅菌(高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌15 min)烘干后，用0.22 μm濾膜過濾噴氣燃料，除去噴氣燃料中的孢子[15]。③在超凈工作臺中，用滅菌沙保氏培養(yǎng)液、過濾3號噴氣燃料和培養(yǎng)3 天的枝孢霉菌構(gòu)建如下培養(yǎng)體系：空白樣1為150 mL沙保氏培養(yǎng)液+850 mL 3號噴氣燃料；空白樣2為150 mL沙保氏培養(yǎng)液+菌液；試驗樣1～試驗樣5為150 mL沙保氏培養(yǎng)液+850 mL 3號噴氣燃料+菌液，其中，試驗樣1和試驗樣2用于測定發(fā)光強(qiáng)度，繪制枝孢霉菌生長曲線；試驗樣3～試驗樣5分別用于測定噴氣燃料上部樣品、中部樣品和下部樣品的性質(zhì)。

1.2.2 枝孢霉菌ATP的檢測在試驗樣1和試驗樣2中分別接入10，100，1 000 μL菌液，放置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(28 ℃)，每4 h檢測一次實驗樣品水相的發(fā)光強(qiáng)度，每個樣品檢測2～5次，取平均值；分別于試驗開始和結(jié)束時對空白樣水相的發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。試驗時先搖動燒瓶中培養(yǎng)體系，使真菌在水相分布均勻后再取樣，用滅菌的移液管取1 mL水樣與1 mL裂解液在5 mL離心管中混合均勻，然后取50 μL混合液進(jìn)行檢測，計算每毫升水中的微生物量。

1.2.3 噴氣燃料的總酸值及培養(yǎng)基pH的檢測按照GBT 12574《噴氣燃料總酸值測定》方法，每天分別取試驗樣3～試驗樣5中的上部樣、中部樣、下部樣檢測噴氣燃料的總酸值；于試驗開始和結(jié)束時檢測一次空白樣1中噴氣燃料的總酸值。取樣時上部樣在油面下方約1 cm處取，中部樣在油樣中間位置取，下部樣在油與培養(yǎng)液界面上方約1 cm處取。

1.2.4 噴氣燃料潔凈性檢測按照GBT 1793《航空燃料水反應(yīng)試驗》方法，磷酸鹽緩沖溶液與噴氣燃料按體積比為1∶4取樣檢測噴氣燃料下部樣的潔凈性，同時按照GBT 22237《表面活性劑表面張力的測定》方法測試噴氣燃料的表面張力；每天取樣前觀察油相、水相以及界面處的狀態(tài)。

1.2.5 噴氣燃料銀片腐蝕試驗按照YLB15—2003方法，檢測噴氣燃料下部樣銀片腐蝕的級別，判斷是否有活性硫化物產(chǎn)生。

2 結(jié)果與討論

2.1 枝孢霉菌生長規(guī)律

以枝孢霉菌培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，各時間點所測的枝孢霉菌發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制枝孢霉菌在培養(yǎng)體系中的生長規(guī)律，結(jié)果見圖1～圖3。從圖1～圖3可以看出：①枝孢霉菌接入培養(yǎng)體系后，由于缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物，需要一個短暫的適應(yīng)期以積累生長繁殖所必需的酶等物質(zhì)，即遲緩期(0～4 h)，遲緩期內(nèi)，枝孢霉菌繁殖速率較為緩慢，生長曲線平坦穩(wěn)定，但代謝活躍，為下階段生長繁殖儲備了充足的酶、能量和中間產(chǎn)物；②經(jīng)過遲緩期緩慢生長，水相發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到400 RLUmL時，枝孢霉菌開始對數(shù)繁殖，生長曲線直線上升，由于初始接入量的不同，枝孢霉菌繁殖生長的基數(shù)不同，在100 μL接入量體系中繁殖生長速率比10 μL接入量體系中快，在更大接入量的1 mL培養(yǎng)體系中枝孢霉菌沒有經(jīng)歷遲緩期，直接進(jìn)入對數(shù)期快速生長，由于培養(yǎng)體系中營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗、有機(jī)酸等毒性代謝產(chǎn)物的積累以及pH下降等不利因素的影響，枝孢霉菌的繁殖速率逐漸下降，而死亡數(shù)目不斷上升，最終新增殖數(shù)與死亡數(shù)趨于平衡，總數(shù)處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，枝孢霉菌的生長進(jìn)入穩(wěn)定期；③枝孢霉菌空白樣2(無噴氣燃料)與試驗樣的生長曲線基本一致，說明試驗過程中真菌的生長主要利用了水相培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)，并沒有大量利用噴氣燃料中的成分；空白樣2的發(fā)光強(qiáng)度有一個陡然下降然后再回升的過程，且培養(yǎng)體系初始接種量越大出現(xiàn)該趨勢的時間越早，說明真菌生長繁殖量有一個臨界點，超過該臨界點時由于營養(yǎng)物質(zhì)不足會導(dǎo)致真菌數(shù)量減少，然后真菌數(shù)量再次上升并穩(wěn)定在臨界點附近；試驗樣的發(fā)光強(qiáng)度雖然也有先下降后回升的趨勢，但該趨勢總體比空白樣2平緩，且出現(xiàn)的時間也略晚，說明雖然試驗過程中噴氣燃料不是枝孢霉菌營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，但還是為真菌的生長提供了有利條件，促進(jìn)了枝孢霉菌的生長。另外，試驗開始和結(jié)束時空白樣1(含噴氣燃料)的發(fā)光強(qiáng)度分別為106.8 RLUmL和120.0 RLUmL，變化不大，說明試驗過程中沒有外界其他菌種進(jìn)入培養(yǎng)體系，消除了干擾因素。

圖1 10 μL接入量時的枝孢霉菌生長曲線■—試驗樣1； ●—試驗樣2； ▲—空白樣2。圖2、圖3同

圖2 100 μL接入量時的枝孢霉菌生長曲線

圖3 1 mL接入量時的枝孢霉菌生長曲線

2.2 噴氣燃料腐蝕性試驗

噴氣燃料總酸值隨時間的變化如圖4所示。從圖4可以看出，隨時間的延長，試驗組噴氣燃料的總酸值不斷增大，8天后試驗結(jié)束時上部樣、中部樣、下部樣總酸值分別從試驗開始時的0.005 3，0.005 4，0.005 5 mgKOHg增加到0.012 8，0.013 5，0.017 1 mgKOHg，下部樣的總酸值增加速率和幅度大于中部樣和上部樣，且第5天起下部樣的總酸值已經(jīng)超出了GB 6537《3號噴氣燃料》規(guī)定的不大于0.015 mgKOHg的標(biāo)準(zhǔn)。但空白樣1在試驗開始和試驗結(jié)束時的總酸值分別為0.005 0 mg KOHg和0.005 7 mg KOHg，在沒有外界其他菌種干擾的情況下噴氣燃料的總酸值沒有明顯變化，且酸值在GB 6537《3號噴氣燃料》規(guī)定范圍內(nèi)。

圖4 噴氣燃料總酸值隨時間的變化■—上部樣； ●—中部樣； ▲—下部樣

培養(yǎng)基pH隨時間的變化如圖5所示。從圖5可以看出，隨時間的延長，試驗組噴氣燃料的pH 呈逐步下降趨勢。這可能是枝孢霉菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，小分子有機(jī)酸溶于水相，降低了培養(yǎng)液的pH，大分子有機(jī)酸溶于油相，增加了噴氣燃料的總酸值。另外，試驗過程中銀片腐蝕級別沒有變化，試驗結(jié)果均為0級，說明試驗過程中，枝孢霉菌沒有分泌產(chǎn)生或僅分泌極少量活性硫化物，不足以影響到銀片腐蝕的試驗結(jié)果。

圖5 培養(yǎng)基pH隨時間的變化

2.3 噴氣燃料潔凈性變化

實驗初期，空白樣和試驗樣均清澈透明，油水界面處清潔干凈。隨著時間的延長，空白樣未發(fā)生明顯變化，但試驗樣油水界面處產(chǎn)生了一層白色薄膜，并逐漸變厚，局部有小顆粒狀物質(zhì)出現(xiàn)。界面處的白色薄膜可能是枝孢霉菌菌絲相互連接形成的。噴氣燃料下部樣的表面張力隨時間的變化如圖6所示。從圖6可以看出，試驗過程中噴氣燃料的表面張力總體呈下降趨勢，這可能是枝孢霉菌代謝過程中產(chǎn)生了表面活性物質(zhì)引起的。表面活性物質(zhì)會增加油水乳化現(xiàn)象，使油中的水更加難以分離，這一方面會影響噴氣燃料的潔凈性，另一方面為微生物在油中的生長繁殖創(chuàng)造了條件，會促進(jìn)微生物的生長繁殖。

圖6 下部樣的表面張力隨時間的變化

水反應(yīng)試驗過程中，油相和水相均不存在乳化物或沉淀，兩相界面清澈、清潔，水反應(yīng)試驗分離程度和界面現(xiàn)象均為1級。表明試驗過程中枝孢霉菌代謝繁殖產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)雖然降低了噴氣燃料的表面張力，但還不足以影響到水反應(yīng)試驗。但長期積累的表面活性物質(zhì)對噴氣燃料的性質(zhì)有潛在影響，因此需要引起關(guān)注。

3 結(jié) 論

(1)枝孢霉菌在代謝繁殖過程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)和表面活性物質(zhì)會增大噴氣燃料的總酸值、降低噴氣燃料的表面張力和溶解水的pH，同時影響噴氣燃料的潔凈性。

(2)噴氣燃料一旦滿足枝孢霉菌生長所需要的水分等條件，枝孢霉菌便會快速生長繁殖。因此在噴氣燃料儲存、使用、管理過程中，有必要定期檢測微生物污染情況，并采取有效處理措施。