楊 娜 ，葉磊海 ，葉佳明 ，裘鈞陶 ，應(yīng)寒松 ，何 斌 ，鐘世歡 ，詹越城

（1.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州 310009；2.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州 310009）

抗菌藥物一般是指具有殺菌或抑菌活性的藥物，包括各種抗生素、磺胺類、咪唑類、硝基咪唑類、喹諾酮類等化學(xué)合成藥物。由細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物經(jīng)培養(yǎng)而得到的某些產(chǎn)物，或用化學(xué)半合成法制造的相同或類似的物質(zhì)，也可化學(xué)全合成?？咕幬镌谝欢舛认聦Σ≡w有抑制和殺滅作用。抗菌藥主要分為八大類，其中β-內(nèi)酰胺類包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、含酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺類、單環(huán)酰胺類等；以及氨基糖苷類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類、葉酸途徑抑制劑類、氯霉素；糖肽類包括萬古霉素和替考拉寧、大環(huán)內(nèi)酯類。

我國衛(wèi)生部頒布的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》明確規(guī)定[1]，化妝品中禁止使用抗生素類物質(zhì)，但不少商家為了追求利益，違規(guī)添加各種違禁物質(zhì)，給人們的日常生活帶來嚴(yán)重的危害。化妝品中添加的抗生素包括喹諾酮類、四環(huán)素類、咪唑類、硝基咪唑類等，當(dāng)這類抗生素違規(guī)添加到化妝品中，散布于人體皮膚表面，人體長期接觸含抗生素成分的化妝品后，會逐漸破壞皮膚表面的正常菌群，導(dǎo)致皮疹、速發(fā)性過敏等不良反應(yīng)，有些還會引起貧血、胃腸道反應(yīng)等。人們可能會由于使用了違法添加成分的化妝品，導(dǎo)致對抗生素類藥物產(chǎn)生耐藥性，給日后人類疾病的治療帶來困難[2-3]。

目前，檢測化妝品中抗菌藥物主要依據(jù)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》[1]，其中每一類藥物的前處理過程都不一樣，不能滿足快速檢測的要求；并且檢測此類藥物的主要方法是高效液相色譜法[4-7]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法2種[8-11]。高效液相色譜法能檢測到的藥物種類有限，且分析時間長、檢測效率低、消耗成本高、達(dá)不到高通量檢測要求，同時也由于化妝品成分復(fù)雜，色譜雜峰多，定性困難。而隨著HPLC-MS應(yīng)用日益廣泛，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于速度快、靈敏度高、定性準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點(diǎn)已成為化妝品中禁限用物質(zhì)檢測的首選方法。

因此，試驗(yàn)旨在建立同時檢測化妝品中多種抗菌類藥物（包括喹諾酮類、四環(huán)素類和咪唑類）含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。結(jié)果表明，該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，已應(yīng)用于化妝品的檢測，可以滿足化妝品質(zhì)量監(jiān)管的需要。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純，美國TEDIA公司提供；氯化鈉，杭州化學(xué)試劑有限公司提供；除非另有說明，所有試劑均為分析純；水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

8種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品：恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、氟羅沙星、雙氟沙星，6種四環(huán)素類標(biāo)準(zhǔn)品：四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素、去甲基金霉素、甲烯土霉素，6種咪唑類標(biāo)準(zhǔn)品：克霉唑、酮康唑、氟康唑、咪康唑、萘替芬、聯(lián)苯芐唑，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

AB Sciex型高效液相色譜儀（配備二元梯度泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱等，USA）；AB Triple Quad 4500型LC-MS/MS配有電噴霧（ESI） 離子源（USA）；TGL-16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；AR2140型電子分析天平，奧豪斯儀器常州有限公司產(chǎn)品；SQP型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司產(chǎn)品；Milli-Q型純水儀，美國Millpore公司產(chǎn)品；IKA MS3 basic型渦旋混合器、KH-500B型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取喹諾酮類、四環(huán)素類和咪唑類標(biāo)準(zhǔn)品0.025 g，各置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，將20種標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成500 μg/mL質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于避光處冷藏保存；使用時用甲醇稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品制備

準(zhǔn)確稱取樣品約0.5 g（精確至0.001 g），置于50 mL具塞比色管中，加入飽和氯化鈉溶液1 mL，渦旋30 s，加入甲醇1 mL，渦旋30 s，再加入甲醇20 mL，渦旋30 s，超聲提取30 min，渦旋30 s，加入甲醇定容至刻度，渦旋1 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，濾液作為待測備用溶液。

1.4 分析條件

色譜條件：Agilent EC-C18（Poroshell 120） 型色譜柱，2.7 μm，3.0 mm×50 mm；流速0.3 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量2 μL；流動相：A 0.2%甲酸水溶液，B乙腈；流動相梯度洗脫：0～1 min，10%B；1～10 min， 10% ～90%B； 10～11 min， 90%B；11～11.2 min，90%～10%B；11.2～15 min，10%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子多反應(yīng)（MRM） 監(jiān)測模式；氣簾氣壓力30 psi，離子化電壓5 500 V，霧化溫度600℃，碰撞氣7，霧化氣和輔助氣都是55 psi。

20種抗生素的質(zhì)譜優(yōu)化條件見表1。

表1 20種抗生素的質(zhì)譜優(yōu)化條件

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化是直接采用針泵恒流進(jìn)樣方式，稀釋成0.5～1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)入離子源，進(jìn)行一級四級桿全掃描找到目標(biāo)化合物母離子并確定母離子的質(zhì)荷比（m/z）；第二步手動調(diào)節(jié)碰撞能量（CE）用來找到合適的子離子作為定性離子和定量離子，并確定子離子的質(zhì)荷比（m/z）；第三步在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM） 下優(yōu)化各個子離子的去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE） 和碰撞池出口電壓（CXP）。然后再優(yōu)化離子源參數(shù)，采用三通進(jìn)樣方式，逐個優(yōu)化氣簾氣壓力、離子化電壓、霧化溫度、霧化氣和輔助氣參數(shù)，已確定最佳的質(zhì)譜條件。具體參數(shù)詳見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別以乙腈、甲醇、0.1%甲酸水和0.2%甲酸水以不同比例組合為流動相，結(jié)果表明，采用0.2%甲酸水-乙腈分離效果較好、靈敏度更佳。分別考查了柱溫、流速對色譜分離效果的影響，最終確定分析柱溫40℃，流速0.3 mL/min。同時考查了洗脫條件對峰形和分離效果的影響，確定了最終的梯度洗脫條件。

2.3 樣品提取方法的條件

根據(jù)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》和相關(guān)文獻(xiàn)，該方法比對了甲醇和乙腈作為提取溶劑的提取效果，最終選定甲醇為提取溶劑。

2.4 線性關(guān)系和檢出限的考查

在確定的色譜和質(zhì)譜條件下，對20種抗生素藥物進(jìn)行測定。用空白基質(zhì)配置標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性方程，通過向陰性樣品中添加目標(biāo)物來考查方法的檢出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）。

2.5 方法回收率和精密度驗(yàn)證

對4種不同基質(zhì)陰性樣品分別進(jìn)行3個質(zhì)量濃度水平6次加標(biāo)回收試驗(yàn)，考查精密度和回收率。

20種抗生素藥物的線性范圍、線性方程、檢出限、定量限、精密度和回收率見表2，20種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖1。

2.6 實(shí)際樣品的檢測

表2 20種抗生素藥物的線性范圍、線性方程、檢出限、定量限、精密度和回收率

圖1 20種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖

用上述檢測方法對市售50個化妝品樣品（包括洗面奶、沐浴液、面霜、乳液等）進(jìn)行了檢測，在樣品中部分檢出四環(huán)素類藥物，部分檢出喹諾酮類藥物，但檢出率不高，且樣品檢測中無干擾。

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定化妝品中多種抗菌類藥物殘留的檢測方法，樣品用甲醇溶液提取，前處理簡單快捷。通過優(yōu)化前處理過程和色譜質(zhì)譜條件，該方法線性關(guān)系好、靈敏度高、重現(xiàn)性好、抗干擾能力強(qiáng)，適用于化妝品中多種抗菌藥物殘留的檢測，對于化妝品的質(zhì)量控制具有重要意義。