阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)作為老年期癡呆最常見的癡呆類型,其發(fā)病過程極為隱匿,記憶力減退是首發(fā)癥狀且進(jìn)行性加重。截至2015年,我國癡呆人數(shù)居世界之最,高達(dá)950萬,同時(shí)預(yù)計(jì)到2050年癡呆人數(shù)將突破1.31億[1-2]。在AD前期發(fā)展過程中,膽堿能神經(jīng)元損傷在認(rèn)知功能下降中扮演著不可或缺的角色,與Aβ沉積并存[3]。本研究通過Aβ誘導(dǎo)老年癡呆模型,頭穴叢刺觀察治療前后AD大鼠海馬及皮層區(qū)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、乙酰膽堿酯酶(AchE)活性變化,從而進(jìn)一步探討其作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量為250～300 g的60只Wistar大鼠均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,普通環(huán)境喂養(yǎng),隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組、模型組、治療組、對(duì)照組,每組15只。

1.2 試驗(yàn)藥物、試劑和儀器 多奈哌齊(安理申)由PFIZER PGM公司生產(chǎn)制造,產(chǎn)品批號(hào):5136903,5 mg/片;Aβ1-42由美國Sigma公司生產(chǎn);Moirrs水迷宮系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);DW-5立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備:10%水合氯醛大鼠腹腔注射麻醉,固定于大鼠腦立體定位儀上,常規(guī)顱頂部剃毛消毒,暴露頭部皮膚沿頭部中線剪開,仔細(xì)將骨膜剔除充分暴露頭骨,選擇雙側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)(前囟點(diǎn)向后3.6 mm,旁開2.7 mm),鉆孔后將10 mL Aβ1-42寡聚體注入其中,每側(cè)5 mL,拔針后清創(chuàng)縫合消毒防止感染[4]。

1.3.2 干預(yù)方法:假手術(shù)組:假手術(shù)組每側(cè)海馬區(qū)注射5 mL蒸餾水。模型組:造模后同等抓握和喂養(yǎng)。對(duì)照組:造模后3 d,參照“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等劑量比值表”給予安理申0.45 mg/(kg·d)灌胃治療。治療組:造模3 d后,在安理申灌胃基礎(chǔ)上根據(jù)于致順教授頭部七區(qū)劃分法,參考《大鼠穴位圖譜》所示,定位大鼠神庭穴、百會(huì)穴及其左右各旁開2 mm處,選用0.25 mm×25 mm針灸針進(jìn)行針刺,針刺方向從后往前(百會(huì)透神庭),快速捻轉(zhuǎn)1 min,1次/d,每次2 h,干預(yù)周期為4周,每周日休息1 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 Morris水迷宮檢測(cè):于針灸治療結(jié)束后次日開始,歷時(shí)5 d[5]。

1.4.2 HE染色:觀察海馬及皮層區(qū)組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4.3 海馬及皮層區(qū)ChAT、AchE活性的變化:采用比色法觀察,具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組與假手術(shù)組相比,大鼠的逃避潛伏期被延長,第二象限百分比和跨越平臺(tái)次數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,對(duì)照組與治療組都大大縮短了AD大鼠逃避潛伏期,增加了第二象限百分比及跨越平臺(tái)的次數(shù)(P<0.05,P<0.01);且治療組優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與對(duì)照組比較,△P<0.05

2.2 海馬及皮層區(qū)組織病理形態(tài)學(xué)影響

2.2.1 海馬區(qū):假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞布列趨勢(shì)較緊密,神經(jīng)元形態(tài)尚規(guī)則,無組織水腫,散見少量凋亡小體和炎性細(xì)胞,血管無充血。模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞布列趨勢(shì)紊亂,神經(jīng)元形態(tài)欠規(guī)則,膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著增加,可見大量神經(jīng)元凋亡小體和炎性細(xì)胞,毛細(xì)血管腫脹。治療組、對(duì)照組大鼠海馬區(qū)病理改變較模型組有明顯改善。主要表現(xiàn)為各組大鼠海馬區(qū)疏松程度明顯減輕,神經(jīng)元細(xì)胞核固縮數(shù)目、膠質(zhì)和炎細(xì)胞數(shù)目明顯減少,毛細(xì)血管腫脹減輕,神經(jīng)細(xì)胞布列趨勢(shì)相對(duì)緊密。見圖1。

2.2.2 皮層區(qū):假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)尚規(guī)則,結(jié)構(gòu)相對(duì)正常。模型組神經(jīng)元形態(tài)欠規(guī)則,數(shù)目減少,膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多。治療組、對(duì)照組大鼠皮層區(qū)病理改變較模型組有明顯改善。主要表現(xiàn)在神經(jīng)細(xì)胞布列較規(guī)則,數(shù)目顯著增多,膠質(zhì)細(xì)胞減少明顯。見圖2。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)組織病理形態(tài)比較(HE染色,×400)

圖2 各組大鼠皮層區(qū)組織病理形態(tài)比較(HE染色,×400)

2.3 頭穴叢刺對(duì)AD大鼠海馬及皮層ChAT活性的影響 與假手術(shù)組比較,模型組海馬皮層區(qū)ChAT水平下降(P<0.01);對(duì)照組海馬和皮層區(qū)ChAT水平與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療組海馬皮層區(qū)ChAT水平與模型組、對(duì)照組相比均升高(均P<0.01)。

假手術(shù)組海馬和皮層區(qū)ChAT水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組、對(duì)照組海馬和皮層區(qū)ChAT水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),海馬區(qū)水平低于皮層區(qū);治療組海馬和皮層區(qū)ChAT水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4 頭穴叢刺對(duì)AD大鼠海馬及皮層AchE活性的影響 與假手術(shù)組相比,模型組海馬皮層區(qū)AchE水平顯著上升(P<0.01);與模型組相比,治療組、對(duì)照組海馬和皮層區(qū)AchE水平均下降(P<0.01或P<0.05);與對(duì)照組相比,治療組海馬皮層區(qū)AchE水平下降(P<0.01或P<0.05)。

圖3 各組ChaT水平比較

假手術(shù)組海馬和皮層區(qū)AchE比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組、對(duì)照組海馬和皮層區(qū)AchE水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),海馬區(qū)水平高于皮層區(qū);治療組海馬和皮層區(qū)。AchE水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組AchE活性比較

3 討論

Aβ假說是AD主流假說之一,該假說認(rèn)為超出常量的具有神經(jīng)毒性的Aβ在癡呆病人腦內(nèi)異常堆積,引起老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和炎癥反應(yīng),最終造成神經(jīng)凋亡[6]。Aβ1-42誘導(dǎo)的AD大鼠模型是被公認(rèn)的較為成功的老年癡呆模型,該模型不僅出現(xiàn)癡呆病人該有的記憶缺損下降,同時(shí)兼具癡呆病人腦內(nèi)神經(jīng)病理學(xué)特征,已被廣泛接受[7-8]。實(shí)驗(yàn)中Aβ用于腦內(nèi)注射的主要成分為Aβ1-40、Aβ25-35、Aβ1-42(毒性最強(qiáng))。與Aβ1-40相比Aβ1-42疏水性更強(qiáng),更利于淡粉樣斑塊沉積,相對(duì)于Aβ25-35,Aβ1-42神經(jīng)纖維纏結(jié)更易于形成，且Aβ1-40、Aβ25-35誘導(dǎo)的AD的模型持續(xù)時(shí)間較短,因此Aβ1-42被運(yùn)用于誘導(dǎo)老年癡呆模型更加貼近老年癡呆病人病理表現(xiàn),模型更易于成功[9]。膽堿能神經(jīng)元由于在腦內(nèi)分布廣泛,主要包括基底前腦膽堿能神經(jīng)元、紋狀體等,因此其支配著幾乎所有的腦區(qū)[2]。而膽堿能損傷假說也是其發(fā)病的重要機(jī)制之一。乙酰膽堿(Ach)作為一種中樞膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)與AD的發(fā)生密切相關(guān),Ach的含量與ChAT和AchE的活性相關(guān):ChAT能夠促進(jìn)Ach的合成而AchE卻能分解Ach,兩者共同維持著Ach的動(dòng)態(tài)平衡[10]。上調(diào)ChAT活性和下調(diào)AchE活性是協(xié)調(diào)機(jī)體內(nèi)Ach平衡的唯一途徑[11]。本研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-42模型大鼠能迅速地出現(xiàn)腦內(nèi)Aβ過度沉積,形成顯著的學(xué)習(xí)記憶低下問題,海馬及皮層區(qū)的ChAT的活性下降、AchE活性升高,其中海馬區(qū)ChAT活性低于皮層區(qū),AchE活性高于皮層區(qū)。對(duì)照組結(jié)果顯示多奈哌齊能夠明顯地抑制AchE,而對(duì)ChAT效果甚微,海馬區(qū)ChAT活性低于皮層區(qū),AchE活性高于皮層區(qū)。治療組結(jié)果顯示頭穴叢刺聯(lián)合鹽酸多奈哌齊療效明顯優(yōu)于單純對(duì)照組,不僅能夠進(jìn)一步上調(diào)ChAT活性,下降A(chǔ)chE活性,且ChAT、AchE活性在海馬和皮層區(qū)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。頭穴叢刺是于志順教授在總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提出的關(guān)于“針場(chǎng)”和“頭部區(qū)域劃分”的頭針理論,在實(shí)驗(yàn)和臨床工作中得到驗(yàn)證并發(fā)揮出顯著的療效,由原先單一的點(diǎn)刺或是線刺擴(kuò)展到面刺,不僅擴(kuò)大了針刺面積同時(shí)加強(qiáng)了刺激量[12],并且針刺時(shí)間也大大延長,長留針不僅縮短了治療時(shí)間同時(shí)也減輕病人由于針刺造成的疼痛。本課題在前期研究中已經(jīng)證實(shí)頭穴叢刺能夠調(diào)控膽堿能系統(tǒng)從而改善AD病人的學(xué)習(xí)記憶狀況[13]。本次實(shí)驗(yàn)將多奈哌齊作為基礎(chǔ)藥物治療配合頭穴叢刺,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療效果更加明確,且兩者都是通過上調(diào)ChAT活性和下調(diào)AchE活性來改善AD病人的學(xué)習(xí)記憶能力。