張夢，馬冬，袁騰，樊少蓓，郭穎，劉佳，李鷗

0 引言

近年來宮頸癌的發(fā)病趨于年輕化，放化療及靶向藥物治療預后仍有約30%的患者出現(xiàn)局部復發(fā)或轉(zhuǎn)移[1]。由于宮頸癌的發(fā)病機制不明確，因此宮頸癌的個體化治療仍難以實現(xiàn)。近年有研究發(fā)現(xiàn)非編碼微小RNA（MicroRNA, miRNA）與宮頸癌細胞凋亡、增殖、侵襲和血管生成等生物學過程密切相關(guān)，被認為是宮頸癌診斷、治療和預后評估的新靶點[2]。miR-135a-5p參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3-5]，但其在宮頸癌中的研究未見報道。

GATA結(jié)合蛋白（GATA）3是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族（GATA1~6）中的一員，它們以高親和力結(jié)合于共同序列（A/T）GATA（A/G），共有一個類固醇激素受體超家族的C4鋅指結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合序列，定位于染色體10p15。生物信息學分析顯示miR-135a-5p與GATA3 3’非翻譯區(qū)（UTR）有結(jié)合位點，提示miR-135a-5p可能通過靶向調(diào)節(jié)GATA3的轉(zhuǎn)錄活性而發(fā)揮作用。

信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）3是STAT家族中的一員，其在許多細胞進程包括細胞生長、凋亡及癌變中起到關(guān)鍵作用。最新研究報道GATA3在某些輔助因子的協(xié)同作用下直接作用于STAT3的啟動子區(qū)從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性[6]。因此推測miR-135a-5p、GATA3及STAT3三者之間可能通過某種作用機制共同參與了宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展。本研究旨在檢測分析不同病理類型宮頸組織及細胞系中miR-135a-5p、GATA3及STAT3的表達變化及相互關(guān)系，以期為宮頸癌的靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年9月—2017年9月唐山市工人醫(yī)院收治的155例宮頸手術(shù)標本，包括宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN組）81例，其中CINⅠ組39例，平均年齡為（44.5±3.1）歲；CINⅡ~Ⅲ組42例，年齡（43.7±6.2）歲；宮頸鱗癌（cervical squamous cell carcinoma, CSCC）37例為宮頸癌組（CSCC組），年齡（45.3±4.2）歲；選取同期因良性子宮疾病行全子宮切除術(shù)的患者37例為正常對照組，年齡（46.7±2.6）歲。四組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.168, P>0.706）。CIN組及CSCC組納入標準：（1）臨床資料完整；（2）病理明確診斷為CINⅠ、CINⅡ~Ⅲ或?qū)m頸鱗癌；（3）術(shù)前未接受過放、化療。排除標準：（1）術(shù)前3月內(nèi)曾行宮頸治療，如陰道用藥、激光治療等；（2）患者為妊娠狀態(tài)；（3）同時合并其他婦科惡性腫瘤，如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等；（4）同時合并其他臟器腫瘤，如腸道、乳腺腫瘤等。正常對照組納入標準：（1）因子宮良性疾病行全子宮切除術(shù)者；（2）宮頸薄層液基細胞學檢查未見非典型鱗狀細胞或癌細胞。排除標準與CIN組及CSCC組相同。所有標本均經(jīng)本院病理科主任醫(yī)師證實，且取材前均未行放、化療或免疫治療。標本收集后于本院中心實驗室-80℃冰箱保存。CSCC組（37例）患者按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2009年的標準進行臨床分期：Ⅰ期27例，Ⅱa期10例；病理分級按2003年WHO標準分為：高分化26例，中低分化11例。本研究經(jīng)唐山工人醫(yī)院倫理委員會批準（批準號：15070），所有患者均知情同意。

1.2 研究。方法

1.2.1 體外細胞培養(yǎng) 正常人宮頸上皮細胞（HcerEpic）和人宮頸癌細胞株HeLa、SiHa細胞均由河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院腫瘤研究所饋贈，分別以含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基、5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細胞密度為4×104/L，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。HEK-293A細胞由河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院腫瘤研究所饋贈，高糖伯克改良伊格爾培養(yǎng)基+10%胎牛血清，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 主要試劑 TRIzol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR反應試劑盒及Lipofectamine 2000試劑盒均購自美國Invitrogen公司；PCR引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；鼠抗人GATA3單克隆抗體、鼠抗人STAT3單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗鼠IgG抗體及鼠抗人β-肌動蛋白抗體購自武漢谷歌生物技術(shù)有限公司；Dualluciferase Assay System購自美國Promega公司。

1.2.3 實時定量RT-PCR檢測不同宮頸組織及宮頸癌細胞系中miR-135a-5p、GATA3和STAT3 mRNA的表達水平[7-9]將液氮保存的宮頸組織按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，以RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。miR-135a-5p莖環(huán)結(jié)構(gòu)：5’-GCCTATGGCTTTTTATTCCTATGT-3’。反轉(zhuǎn)錄條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，75℃ 15 min。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后進行PCR擴增。PCR反應體系按試劑盒說明配制。具體引物序列：miR-135a-5p-F：5’-TTGGTCTTGTTTCCCGGTCC-3’；miR-135a-5p-R：5’-TCACAGCTCCACAGGCTAAC-3’；GATA3-F：5’-AAGGCATCCAGACCAGAAACCG-3’；GATA3-R：5’-AGCATCGAGCAGGGCTCTAACC-3’；STAT3-F：5’-AAGAGGCGGCAACAGATT-3’；STAT3-R：5’-CGGTCTTGATGCCGAGGG-3；U6-F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；U6-R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；GAPDH-F：5’-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3’；GAPDH-R：5’-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3’。PCR擴增的反應條件為：95℃ 2 min，95℃ 15 s，72℃ 35 s共35個循環(huán)，記錄循環(huán)閾值（Ct），采用2-ΔΔCt法計算miR-135a-5p、GATA3和STAT3 mRNA的相對表達量。每組實驗重復3次。miR-135a-5p以U6為內(nèi)參基因；GATA3和STAT3 mRNA以GAPDH為內(nèi)參基因。

1.2.4 免疫組織化學SP法分析不同宮頸組織中GATA3和STAT3的表達水平 用4%多聚甲醛固定四組宮頸組織24 h，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片，將切片放置在PCI系列正電荷處理過的黏附載玻片上。樣本放置65℃恒溫烤箱內(nèi)干燥處理3 h。經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇洗滌水化，pH=6的枸櫞酸鹽高壓修復之后，用3%、pH值為7.2~7.4的過氧化氫甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，再分別用山羊血清和兔血清封閉非特異性抗原，加入其對應一抗（鼠抗人GATA3抗體，1:50稀釋；鼠抗人STAT3，1:100稀釋），4℃孵育過夜后，再加入各自的二抗，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精對比染色，梯度乙醇及二甲苯脫水，中性樹膠封片。正置尼康顯微鏡下觀察、拍照（最大倍數(shù)×400）。結(jié)果判定標準：以細胞核出現(xiàn)棕色染色者為陽性細胞。高倍鏡（×400）下隨機選取5個不同視野，依照陽性細胞所占百分比及染色強度進行評分。陽性細胞所占百分比評分：<5%為0分，5%~25%為1分，≥25%~50%為2分，≥50%~80%為3分，≥80%為4分；染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，以兩種評分的5個視野平均分相乘作為該標本的最終得分；最終得分0分為陰性（-），1~4分為弱陽性（+），5~8分為中等陽性（++），9～12分為強陽性（+++），以-～+為陰性表達，++~+++為陽性表達，計算陽性表達率。

1.2.5 Western blot檢測宮頸細胞系中GATA3和STAT3蛋白的表達 以鼠抗人GATA3單克隆抗體（稀釋濃度1:500）、鼠抗人STAT3單克隆抗體（稀釋濃度1:500）和辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗鼠IgG抗體（稀釋濃度1:1 000）分別室溫溫育2 h；鼠抗人β-肌動蛋白抗體（稀釋濃度1:1 000）和HRP標記的兔抗鼠IgG抗體（稀釋濃度1:2 000）室溫溫育2 h，DAB顯色。采用Image J凝膠圖像處理系統(tǒng)分析計算光帶的吸光度值，以目標蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值來表示目的基因相對蛋白表達水平。

1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染 在HeLa細胞中轉(zhuǎn)染miR-135a-5p mimic及陰性對照mimic Negative Control（miRNC），轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000試劑盒，步驟按照產(chǎn)品說明書進行。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因分析miR-135a-5p與GATA3 3’UTR的相互作用 構(gòu)建GATA3 3’UTR報告載體3’UTR-WT（序列：5’-ACCCCAUCUGUGAAUAAGCCAUU-3’），及突變型報告載體3’UTR-MT（突變序列：5’-ACCCCAUCUGUUGGUAAGCCAUU-3’），將miR-135a-5p mimic和miR-NC共轉(zhuǎn)染入HEK-293A細胞，使用Dual-luciferase assay system檢測轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布，以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析進行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織和細胞中miR-135a-5p的表達情況

實時定量RT-PCR結(jié)果顯示：miR-135a-5p在宮頸癌組中表達上調(diào)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.03），見圖1A。同時檢測HcerEpic、HeLa、SiHa細胞系中miR-135a-5p的相對表達水平，結(jié)果顯示：與HcerEpic組相比，HeLa和SiHa細胞中miR-135a-5p表達上調(diào)（P=0.02），見圖1B。

2.2 不同宮頸組織中GATA3和STAT3的表達

圖1 實時定量RT-PCR法檢測miR-135a-5p在宮頸癌組織(A)和不同宮頸細胞(B)中的表達Figure1 Expression of miR-135a-5p in cervical cancer tissues(A) and defferent cervical cell lines(B) detected by RT-PCR

實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示：GATA3 mRNA在正常對照組、CINⅠ組、CINⅡ~Ⅲ組、CSCC組的表達量分別為：5.53±1.18、6.42±1.26、1.21±0.54、0.63±0.26，正常對照組與CINⅠ組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其余三組比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=38.21, P<0.05）。正常對照組、CINⅠ組、CINⅡ~Ⅲ組、CSCC組STAT3 mRNA表達量分別為：0.62±0.21、0.95±0.33、2.74±0.65、4.26±0.76，四組比較差異有統(tǒng)計學意義（F=42.06, P<0.05），見圖2。

進一步行免疫組織化學結(jié)果顯示：GATA3蛋白的陽性表達主要定位于細胞核，陽性細胞多位于基底層及副基底層細胞中。在正常對照組及CINⅠ組中，GATA3陽性表達的細胞較多，隨著宮頸病變進展，CINⅡ~Ⅲ組中GATA3陽性表達的細胞數(shù)明顯減少，而在CSCC組中幾乎未見GATA3表達，見圖3；GATA3陽性表達率分別為：正常對照組86.5%（32/37）、CINⅠ組89.7%（35/39）、CINⅡ~Ⅲ組9.5%（4/42）、CSCC組2.7%（1/37），四組間分別比較：正常對照組與CINⅠ組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其余各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。STAT3蛋白陽性表達為細胞質(zhì)中出現(xiàn)不同染色程度的棕黃色顆粒，少數(shù)位于細胞核，與GATA3表達情況相反，隨著宮頸病變的進展，STAT3陽性表達的細胞數(shù)目增多，見圖4；STAT3陽性表達率分別為：正常對照組5.4%（2/37）、CINⅠ組12.8%（5/39）、CINⅡ~Ⅲ組71.4%（30/42）、CSCC組91.9%（34/37），四組間分別比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。

圖2 實時定量RT-PCR檢測四組宮頸組織中GATA3(A)、STAT3(B) mRNA表達Figure2 Expression of GATA3(A) and STAT3(B) mRNA in different cervical tissues detected by RT-PCR

2.3 HcerEpic及HeLa和SiHa宮頸癌細胞系中GATA3、STAT3的表達情況

Western blot結(jié)果顯示：與HcerEpic比較，GATA3條帶灰度值在HeLa及SiHa細胞中降低，而STAT3條帶灰度值在HeLa及SiHa細胞中升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖5A，而HeLa、SiHa細胞中GATA3及STAT3條帶灰度值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。實時定量RT-PCR結(jié)果顯示：與HcerEpic比較，GATA3蛋白在HeLa及SiHa細胞中表達減少，而STAT3蛋白在HeLa及SiHa細胞中表達增多，差異有統(tǒng)計學意義（F=52.49, P<0.05），HeLa及SiHa細胞中GATA3、STAT3蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=3.34, P>0.05），見圖5B。mRNA檢測結(jié)果與蛋白表達結(jié)果一致，見圖5C。

圖3 免疫組織化學顯示GATA3在不同病理類型宮頸組織中的表達Figure3 Expression of GATA3 protein in different pathological types of cervical tissues detected by immunohistochemistry method

2.4 miR-135a-5p可靶向調(diào)控GATA3的轉(zhuǎn)錄活性

采用TargetScan預測miR-135a-5p的靶基因，結(jié)果表明：miR-135a-5p與GATA3 3’UTR具有結(jié)合位點，見圖6A。進一步雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示：與miR-NC組比較，過表達miR-135a-5p后帶有GATA3 3’UTR的熒光素酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在結(jié)合位點突變后，即在GATA3 3’UTR-MUT中miR-NC組與miR-135a-5p mimic組熒光素酶活性無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖6B，說明miR-135a-5p可靶向調(diào)控GATA3的轉(zhuǎn)錄活性。

圖4 免疫組織化學顯示STAT3在不同病理類型宮頸組織中的表達Figure4 Expression of STAT3 protein in different pathological types of cervical tissues detected by immunohistochemistry method

2.5 宮頸癌組織中miR-135a-5p、GATA3和STAT3 mRNA表達水平的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：在宮頸癌中miR-135a-5p與GATA3 mRNA的相對表達量呈負相關(guān)（r=-0.6656, P<0.05），見圖7A；GATA3與STAT3 mRNA相對表達量呈負相關(guān)（r=-0.4534,P<0.05），見圖7B。

2.6 miR-135a-5p及GATA3 mRNA表達與宮頸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

圖5 GATA3、STAT3蛋白和mRNA在不同宮頸細胞系中的表達Figure5 Expression of GATA3, STAT3 protein and mRNA in different cervical cell lines

圖6 雙熒光素酶報告基因驗證miR-135a-5p與GATA3 3’UTR的靶向作用Figure6 Targeting effect between miR-135a-5p and GATA3 3’UTR verified by dual-luciferase reporter assay system

結(jié)果顯示：miR-135a-5p的表達量與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；GATA3 mRNA的表達量與臨床分期、間質(zhì)浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

3 討論

目前已證實高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的初始步驟，但其發(fā)生發(fā)展是眾多因素共同作用的結(jié)果，miRNA被認為是此過程中的重要因素[10]。已有研究表明miR-135a-5p在多種人類惡性腫瘤中起到原癌基因或抑癌基因的作用[5]。本研究結(jié)果顯示：隨著宮頸病變進展miR-135a-5p表達上調(diào)，且與宮頸癌臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，提示miR-135a-5p可能作為原癌基因參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

表1 miR-135a-5p、GATA3 mRNA表達量與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 (2-ΔΔCt, ±s)Table1 Relationship of miR-135a-5p, GATA3 mRNA expression with clinicopathological features of cervical squamous cell carcinoma patients (2-ΔΔCt, ±s)

表1 miR-135a-5p、GATA3 mRNA表達量與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 (2-ΔΔCt, ±s)Table1 Relationship of miR-135a-5p, GATA3 mRNA expression with clinicopathological features of cervical squamous cell carcinoma patients (2-ΔΔCt, ±s)

Clinicopathological parameters t P Age(years) 0.657 0.439 0.743 0.527≤50 25 5.3±0.4 4.1±0.9>50 12 4.5±1.8 3.7±1.1 Tumour size(cm) 1.364 0.268 0.972 0.476≤3 22 9.6±1.1 3.3±0.6>3 15 13.4±0.6 4.2±1.1 Differentiation 2.814 0.142 2.742 0.094 Well 26 8.7±0.4 2.7±0.5 Moderate, poor 11 14.6±0.7 4.1±0.6 Clinical stage 2.541 0.024 2.972 0.017Ⅰ27 11.7±0.9 4.4±1.0Ⅱa 10 6.8±0.5 4.5±0.7 Invasion depth 2.625 0.126 2.826 0.024≤1/2 28 9.8±0.7 2.3±0.8>1/2 9 8.3±0.9 4.4±1.7 n miR-135a-5p expression t P GATA3 mRNA expression Lymph node metastasis 2.931 0.021 2.947 0.014 Yes 7 8.6±1.1 4.9±1.3 No 30 15.7±0.8 2.6±0.8

GATA3是一種在乳腺、尿路上皮和T細胞亞群分化過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。在動物模型的研究中表明，GATA3在乳腺癌的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用[11]，GATA3的表達缺失往往提示著乳腺腫瘤的進展甚至轉(zhuǎn)移[12]。乳腺癌組織標本的免疫組織化學實驗研究表明，低表達水平的GATA3提示較高的腫瘤分期及較差的預后，因此GATA3被認為是乳腺腫瘤的抑制因子[13-14]。另有研究表明，GATA3可通過調(diào)節(jié)參與腫瘤進展及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子從而抑制膀胱癌細胞遷移及浸潤，但不抑制細胞增殖[15]。相比之下，GATA3在宮頸癌中的研究較少。本研究結(jié)果顯示，隨著宮頸病變程度的進展，GATA3 mRNA表達水平下調(diào)，尤其在CSCC組中幾乎未見GATA3的表達，對其表達水平與宮頸癌的臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性進行分析，顯示GATA3 mRNA的表達量與宮頸癌的臨床分期、間質(zhì)浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性，由此推測GATA3可能是作為宮頸癌的抑制因子參與疾病進展。GATA3是一種轉(zhuǎn)錄因子，其表達受上游信號如miRNA等的調(diào)節(jié)。采用生物信息學分析對GATA3的上游miRNA進行篩選，發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p與GATA3相關(guān)性較大，并與GATA3 3’UTR有結(jié)合位點，進一步的雙熒光素酶報告基因結(jié)果證實miR-135a-5p可與GATA3 3’UTR結(jié)合而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性，推測在宮頸癌中miR-135a-5p可靶向抑制GATA3的表達而發(fā)揮功能，但其分子機制有待進一步的實驗驗證。

STAT3在人類多種惡性腫瘤如乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、急性淋巴細胞白血病中高表達，其過度表達與腫瘤的增殖、細胞凋亡抑制、侵襲和轉(zhuǎn)移、新血管生成以及腫瘤干細胞（cancer stem cells, CSCs）的自我更新和分化等密切相關(guān)[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，GATA3可抑制STAT3的表達活性，而在膀胱癌干細胞中GATA3活性受抑制，解除了其對STAT3的抑制作用，導致STAT3的高表達[6]，本研究結(jié)果顯示，隨著宮頸病變的進展，STAT3表達上調(diào)，在CSCC組中表達最強，提示STAT3在宮頸癌中亦被過度激活，呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，對CSCC組中GATA3與STAT3 mRNA的表達水平進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈負相關(guān)，符合已有研究結(jié)果的表達趨勢，由此推測在宮頸癌中miR-135a-5p通過抑制GATA3的轉(zhuǎn)錄活性進而激活STAT3的表達，過度激活的STAT3作用于下游信號分子如CyclinD1、Survivin、IL-10等，而IL-10處于免疫調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，IL-10的高表達可通過多種途徑抑制機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的殺傷作用[18]，如IFN-γ表達抑制[19]，造成免疫逃逸，進而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。本次研究的局限性在于僅從組織及細胞水平檢測miR-135a-5p、GATA3及STAT3的表達情況及其相關(guān)性，課題組將在后續(xù)實驗中進一步揭示miR-135a-5p/GATA3/STAT3在宮頸癌中的分子機制，以期為宮頸癌的病理診斷及靶向治療提供新的分子靶點。