段萍萍，艾麗梅

0 引言

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）以骨髓漿細(xì)胞的惡性增生為特征，是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于淋巴瘤，在我國的發(fā)病率約為1/10萬[1]。傳統(tǒng)的多發(fā)性骨髓瘤治療。方法包括化療、放療以及造血干細(xì)胞移植，但治療效果不理想。多發(fā)性骨髓瘤到目前為止依然被認(rèn)為是一種不可治愈的疾病[2]，對大多數(shù)骨髓瘤患者的治療目的是改善其生活質(zhì)量、延長生存期。有臨床研究表明：生物治療對多發(fā)性骨髓瘤具有良好的療效[3-4]。因此，尋找多發(fā)性骨髓瘤生物治療的潛在靶點，已經(jīng)成為目前血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究的熱點。

Toll樣受體4（Toll like receptors 4, TL R4）是一種模式識別受體，屬于Ⅰ型跨膜蛋白[5]，是人類發(fā)現(xiàn)的第1個TLR樣相關(guān)蛋白，分布于多種組織和細(xì)胞中。研究表明，TLR4通過對入侵的病原相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular patterns, PAMP）或損傷相關(guān)分子模式（damage- associated molecular patterns,DAMP）的識別，從而啟動機體的固有免疫和獲得性免疫[6]。 TLR4在炎性反應(yīng)、免疫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的影響，能夠激活Myd88/NF-κB信號通路、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸、促進腫瘤細(xì)胞的增殖和惡化、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，提示TLR4可能會成為腫瘤生物治療的新靶點。因此，本研究觀察了TLR4抑制劑TAK-242對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226 增殖、凋亡的影響，并探究可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院實驗室贈予。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自加拿大ABM公司。引物合成及測序均由上海生物工程科技有限公司完成，見表1。Myd88、NF-κB、GAPDH抗體購自英國Abcam公司，TAK-242購自法國InvivoGen公司，RPMI1640培養(yǎng)液購自美國HyClone公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，Annexin-V/PI試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

表1 PCR引物序列Table1 Sequences of PCR primers

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞株復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，采用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)液（青霉素100 u/ml和鏈霉素100 μg/ml），于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2~3天換液或傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。將RPMI8226細(xì)胞分為A、B、C組及對照組（control），其中A、B、C組分別加入終濃度為20、40、80 μmol/L的TAK-242培養(yǎng)（濃度選擇參考文獻[7]）, 對照組不加抑制劑。

1.2.2 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期RPMI8226細(xì)胞接種于96孔板，每孔6×103個細(xì)胞，每組設(shè)4個平行孔，按照上述。方法分為4組，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入10 μl CCK-8。用自動酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔細(xì)胞在450 nm波長處的吸光度值（OD值），根據(jù)吸光度值分析細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞增殖抑制率=（1-OD實驗組/OD對照組值）× 100%，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 Annexin-V/PI檢測各組細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期RPMI8226細(xì)胞接種于6孔板，每孔4×105個細(xì)胞，按照上述。方法分為4組，放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后取各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次，收集細(xì)胞后加入100 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，然后加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI Staining Solution并輕輕混勻，室溫、避光條件下反應(yīng)15 min 。加入400 μl 5×Binding Buffer混勻后用流式檢測專用的試管收集標(biāo)本，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.4 RT-PCR檢測各組細(xì)胞TLR4、Myd88 mRNA表達水平 采用1.2.3中的。方法收集細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，然后用NanoDrop ND-2000超微量分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。根據(jù)ABM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用20 μl RT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：25℃ 10 min, 42℃ 50 min, 85℃ 5 min。按照ABM說明書，配制qPCR反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min×1；95℃變性15 s，60℃退火60 s，共40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，2-ΔΔCt法計算TLR4、Myd88 mRNA的相對表達水平。

1.2.5 Western blot檢測細(xì)胞Myd88、NF-κB的蛋白表達情況 同樣的。方法收集細(xì)胞后用RIPA裂解液在冰上裂解20 min，4℃ 、12 000 r/min離心10 min后取含全蛋白的上清液，用BCA法進行蛋白定量。然后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，采用5%BSA室溫封閉2 h，TBST洗膜5 min×3次，加入Myd88、NF-κB、GAPDH的一抗（稀釋比例均為1:1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3遍，每次10 min。再加入二抗室溫下雜交1.5 h，TBST洗膜3遍，每次10 min，應(yīng)用ECL顯色劑顯影并保存，用Image J軟件分析條帶的灰度值，計算條帶Myd88、NF-κB與GAPDH條帶的灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的檢驗先采用單因素方差分析，若整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進一步多重比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Toll樣受體4抑制劑TAK-242對細(xì)胞RPMI8226增殖抑制率的影響

CCK-8結(jié)果顯示，與對照組（0）比較，A、B、C三組多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，分別為（27.76±3.85）%、（47.50±2.78）%、（73.43±1.69）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。提示TLR4抑制劑具有抑制RPMI8226細(xì)胞增殖的作用，見圖1。

圖1 CCK-8法檢測不同濃度抑制劑對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226增殖的抑制作用Figurel Inhibition effect of TAK-242 at different concentrations on proliferation of human multiple myeloma cell lines RPMI8226 detected by CCK-8 assay

2.2 Toll樣受體4抑制劑TAK-242對細(xì)胞RPMI8226凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的抑制劑處理RPMI8226細(xì)胞24 h后，隨著抑制作用濃度的增加，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡率逐漸升高，分別為A組（34.67±5.03）%、B組（42.33±2.52）%、C組（55.67±5.13）%，各濃度組與對照組（19.67±2.52）%之間的凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。提示TLR4抑制劑具有促進RPMI8226細(xì)胞凋亡的作用，見圖2。

2.3 Toll樣受體4抑制劑TAK-242對RPMI8226細(xì)胞TLR4、Myd88 mRNA表達水平的影響

結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的抑制劑處理RPMI8226細(xì)胞24 h后，隨著抑制作用濃度的增加，TLR4、Myd88 mRNA相對表達量逐漸降低，各濃度組與對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，C組TLR4、Myd88 mRNA相對表達量明顯降低（P=0.049、P=0.014），A組、B組TLR4、Myd88 mRNA相對表達量顯著降低（P=0.000），見圖3。

2.4 Toll樣受體4抑制劑TAK-242對RPMI8226細(xì)胞Myd88、NF-κB的蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的抑制劑處理RPMI8226細(xì)胞24 h后，隨著抑制作用濃度的增加，Myd88、NF-κB的蛋白相對表達量逐漸降低，各濃度組與對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，B組Myd88蛋白相對表達量（P=0.000）、C組NF-κB的蛋白相對表達量（P=0.002）顯著降低，見圖4。

3 討論

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度抑制劑作用24h后人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226的凋亡率Figure2 Apoptosis rate of human multiple myeloma cell lines RPMI8226 after 24h of TAK-242 treatment at different concentrations detected by fl ow cytometry

圖3 RT-PCR檢測不同濃度抑制劑作用后人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞TLR4、Myd88 mRNA的表達水平Figure3 TLR4 and Myd88 mRNA expression in human multiple myeloma cells treated with different concentrations of TAK-242 detected by RT-PCR

圖4 Western blot檢測不同濃度抑制劑作用后人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞Myd88、NF-κB的蛋白表達情況Figure4 Expression of Myd88 and NF-κB in human multiple myeloma cells treated with different concentrations of TAK-242 detected by Western blot

TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族（TLRs）相關(guān)性蛋白，在TLRs中占有重要位置，其結(jié)構(gòu)分為3部分：胞內(nèi)段、跨膜區(qū)、胞外段，可以調(diào)控共刺激信號分子和細(xì)胞因子的表達，也可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡以及腫瘤微環(huán)境的形成。TLR4信號通路有兩條：一條為Myd88依賴性信號途徑，另一條為Myd88非依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[8]，其中以Myd88依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最為常見。髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor88,Myd88）是一種含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，被認(rèn)為是TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中最重要的接頭蛋白。它的本質(zhì)是一種細(xì)胞質(zhì)可溶性蛋白，是Toll樣信號通路中最關(guān)鍵的銜接分子[9]。Myd88依賴性信號途徑通過激活Myd88，最終開啟MAPK和NF-κB信號通路，以及促炎性反應(yīng)因子、共刺激分子的表達；Myd88非依賴性信號途徑則不依賴于Myd88蛋白的激活，主要是通過干擾素調(diào)節(jié)因子3（IFN regulatory factor 3, IRF-3）來延遲性激活NF-κB的活性。TLR4信號通路在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞中的作用被廣泛報道[10-13]，而在多發(fā)性骨髓瘤中的表達和意義及其作用機制較少有文獻報道。

TLR4是近些年腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，靶向TLR4的小分子特異性抑制劑有望成為腫瘤治療的新藥[14]。TAK-242是TLR4胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的選擇性特異性抑制劑[15-16]，目前已經(jīng)證實了其在體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗中具有抗腫瘤的作用[17]，但是對于其在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡中的作用目前尚無相關(guān)報道。

為了明確TLR4信號通路在多發(fā)性骨髓瘤進展中的作用，本研究經(jīng)不同濃度的TLR4抑制劑處理多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞，結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞TLR4、Myd88 mRNA表達水平降低，同時Myd88、NF-κB蛋白表達量也降低，提示通過抑制TLR4信號通路可以顯著抑制NF-κB的表達水平，與2016年Gao等[18]的報道相似。NF-κB是一種氧化還原敏感蛋白復(fù)合物，是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在炎性和免疫反應(yīng)中起重要作用。在正常情況下，通常NF-κB以與p50、p65結(jié)合形成異二聚體的形式存在，并且與NF-κB抑制蛋白（inhibitor proteins of NF-κB, IκB）結(jié)合形成三聚體，滯留在細(xì)胞質(zhì)中，TLR4信號通路被激活后，IκB發(fā)生磷酸化，進而和NF-κB解離，三聚體被降解，NF-κB由此活化后遷移進入細(xì)胞核內(nèi)，活化并啟動包括TNF-α、IL-1β、IL-6在內(nèi)的多種炎性反應(yīng)介質(zhì)的表達，完成信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，然而炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生會反過來激活NF-κB，炎性反應(yīng)被放大，由此引發(fā)炎性反應(yīng)的級聯(lián)作用。因此，NF-κB在炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)中起著非常重要的調(diào)控作用[19]，而大多數(shù)癌癥的發(fā)生、發(fā)展往往與NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)通路有著密不可分的聯(lián)系[20]。此外，NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞凋亡也密切相關(guān)[21]。NF-κB被活化后通過對凋亡基因的調(diào)控，進而調(diào)控下游蛋白表達來參與細(xì)胞的凋亡過程，最終導(dǎo)致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-3）的活化，Caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡過程的最后關(guān)鍵步驟。以往研究發(fā)現(xiàn)，TLR4信號通路對多發(fā)性骨髓的增殖和凋亡起重要作用[22-33]。本研究結(jié)果表明，TLR4信號通路被抑制后，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖抑制率、凋亡率均增高，且隨TAK-242濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率亦隨之增高，說明TAK-242可抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖、促進細(xì)胞凋亡。

綜上所述，To l l樣受體4特異性抑制劑TAK-242可抑制人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖、促進細(xì)胞凋亡，其機制可能為抑制TLR4/Myd88/NF-κB信號通路，提示阻斷TLR4可能是治療多發(fā)性骨髓瘤的潛在。方法，未來需在動物實驗中進一步實驗去驗證TAK-242對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響。