楊啟，萬春，呂新遠(yuǎn)

0 引言

肝癌作為一種常見的惡性腫瘤具有惡性程度高、進(jìn)展迅猛等特點，同其他惡性腫瘤一樣，肝癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其涉及到一系列基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，這些基因的異常表達(dá)通常與腫瘤細(xì)胞周期、凋亡等生物學(xué)特性有關(guān)[1-2]。Engrailed-2（EN2）屬于非Ⅰ類同源性盒基因家族成員，其具有特異性結(jié)合DNA調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用，目前的研究表明，EN2參與腫瘤發(fā)生，在正常細(xì)胞中高表達(dá)EN2可以促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖，縮短細(xì)胞周期[3-5]。EN2在肝癌組織中高表達(dá)，對于其在肝癌細(xì)胞凋亡中的作用尚不明確[6]。本研究擬通過敲低肝癌細(xì)胞中EN2的表達(dá)水平，明確EN2在肝癌細(xì)胞凋亡中的作用，為以后靶向EN2治療肝癌和研究肝癌的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HB-9018肝癌細(xì)胞HuH-7購自美國ATCC細(xì)胞庫；EN2 siRNA和siRNA陰性對照慢病毒載體由廣州輝駿生物科技有限公司構(gòu)建；E092 SYBR Green qRT-PCR Super Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑均購自德國Qiagen公司 ；ab28731EN2抗體購自美國Abcam公司；12963細(xì)胞色素C（Cytochrome C）抗體、52873激活型Caspase-9（Cleaved Caspase-9）抗體、9559第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10, PTEN）抗體、9661激活型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）抗體、12231細(xì)胞周期素B 1（Cyclin B l）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；70-MJ101JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；BC3740胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 慢病毒感染

人肝癌細(xì)胞HuH-7接種到12孔細(xì)胞板中，觀察細(xì)胞融合度為60%時進(jìn)行感染，添加適量的慢病毒液，使MOI=10，同時在細(xì)胞中加入polybrene（濃度為5 μg/ml），培養(yǎng)12 h以后，將慢病毒培養(yǎng)液吸棄以后，更換新鮮的培養(yǎng)液，在感染后72 h觀察熒光表達(dá)情況，感染率高于85%時可用于后續(xù)實驗。取穩(wěn)定感染EN2 siRNA和siRNA陰性對照（NC）慢病毒的HuH-7細(xì)胞標(biāo)記為EN2 siRNA、siRNA-NC，未感染慢病毒的細(xì)胞作為空白對照（Control）。

1.3 qRT-PCR測定干擾效果

RNA抽提：Control、EN2 siRNA、siRNA-NC細(xì)胞中添加TRIzol，靜置5 min，添加1/5 TRIzol體積的氯仿，振蕩混合30 s，將水相層和有機(jī)相混合以后，靜置2 min分層，吸取上層水相層溶液與500 μl的異丙醇輕輕混合后，置于室溫中結(jié)合10 min，此時RNA存在于底部沉淀中，用75%的乙醇將RNA洗滌，風(fēng)干，溶解在DEPC水中。反轉(zhuǎn)錄：1.0 μg RNA85℃孵育5 min后，立即放于冰上冷卻，PCR管中配制反轉(zhuǎn)錄體系（0.5 μl Oligo dT，0.5 μl Random primer，2.0 μl的10 mmol/L dNTP，4.0 μl 5×Buffer，0.5 μl M-MLV），30℃反應(yīng)10 min，42℃反應(yīng)60 min，85℃反應(yīng)10 min。PCR反應(yīng)：取5.0 μl cDNA，添加0.5 μl上下游引物、10 μl 2×SYBR Green qRT-PCR Super Mix、4.0 μl的dH2O，95℃變性5 min后，95℃反應(yīng)15 s，60℃反應(yīng)32 s，72℃反應(yīng)30 s，循環(huán)40次。使用Ct值進(jìn)行分析，內(nèi)參為β-actin。EN2上游：5’-TCTTGGAGTGGCTGCTTCTG-3’，下游：5’-TCCTGGAGGATTCTGAGTTCTT -3’。β-actin上游：5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’，下游：5’-TCTGCGCAACTTAGGTTTTG-3’。

1.4 Western blot測定干擾效果

細(xì)胞蛋白提取：Control、EN2 siRNA、siRNA-NC細(xì)胞中添加PIRA裂解液，冰上孵育30 min，4℃，12 000 g離心10 min后，吸取上清液，用Bradford法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳：配制8%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白同上樣緩沖液混合煮沸5 min變性，用恒壓80 V電泳約50 min以后，蛋白進(jìn)入到分離膠，120 V恒壓電泳2 h，關(guān)閉電泳，取出凝膠，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜80 min，將NC膜在5%的牛血清白蛋白中室溫孵育1 h，取出封閉后的NC膜，放在TBST中室溫洗滌3次，每次5 min。同1:200稀釋的EN2抗體在4℃結(jié)合過夜，TBST中洗滌3次，每次5 min。再與1:6 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗在室溫結(jié)合2 h后，TBST中洗滌3次，每次5 min。ECL化學(xué)發(fā)光，使用Lab Works對電泳的條帶分析灰度值，以β-actin作為參照。

1.5 細(xì)胞活力測定

細(xì)胞活力檢測用MTT法，步驟為：Control、EN2 siRNA、siRNA-NC細(xì)胞配制成4×104個/毫升的細(xì)胞懸浮液，分別種植到96孔板（每孔添加100 μl），分別在各個時間點（24、48、72和96 h）將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，加入MTT溶液，孵育4 h，棄上清液。繼續(xù)添加150 μl的DMSO，用不含細(xì)胞的孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上讀板，測定490 nm波長處的A值。

1.6 PI單染法測定細(xì)胞周期檢測

Control、EN2 siRNA、siRNA-NC細(xì)胞配制成每毫升含有1×106個細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液，取1 ml至離心管中，2 000 g離心10 min，添加預(yù)冷后的PBS洗滌細(xì)胞3次，用預(yù)冷的75%甲醇懸浮后在4℃條件過夜，離心后，添加PI染液，4℃反應(yīng)30 min，置于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞周期。

1.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡

Control、EN2 siRNA、siRNA-NC細(xì)胞配制成每毫升含有1×106個細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液，取1 ml至離心管中，2 000 g離心10 min，PBS洗滌3次，添加200 μl緩沖液，加入PI和Annexin V-FITC染液，再加入300 μl緩沖液，立即置于流式細(xì)胞儀上檢測。

1.8 Western blot。方法檢測細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、PTEN及Cyclin B1蛋白表達(dá)

步驟同1.4，Cleaved Caspase-3抗體稀釋倍數(shù)為1:200、Cleaved Caspase-9抗體稀釋倍數(shù)為1:200、PTEN抗體稀釋倍數(shù)為1:400及Cyclin B1抗體稀釋倍數(shù)為1:400。

1.9 線粒體膜電位及胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白檢測

細(xì)胞線粒體膜電位檢測用JC-1法，結(jié)果用紅色熒光與綠色熒光的比值表示，具體的操作步驟同杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司70-MJ101線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1法）說明書，細(xì)胞胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白檢測。方法用Western blot，步驟同1.4，用北京索萊寶科技有限公司BC3740胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取胞質(zhì)蛋白。

1.1 0 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 敲低EN2后的檢測結(jié)果

肝癌細(xì)胞感染EN2 siRNA慢病毒后，細(xì)胞中的EN2轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平均降低（mRNA: F=70.336,P=0.000；蛋白：F=29.404, P=0.001），見圖1。表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定下調(diào)EN2表達(dá)的肝癌細(xì)胞株。

2.2 細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果

肝癌細(xì)胞經(jīng)MTT檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，敲低EN2表達(dá)的細(xì)胞24、48、72和96 h的A值明顯降低（24 h: F=8.690, P=0.017; 48 h: F=16.814,P=0.004；72 h: F=23.165, P=0.002; 96 h: F=35.707,P=0.001），細(xì)胞活力降低，見圖2。表明敲低EN2降低肝癌細(xì)胞活力。

2.3 細(xì)胞周期變化檢測結(jié)果

與對照組相比，敲低EN2表達(dá)的肝癌細(xì)胞G2/M期比例明顯升高（G0/G1期：F=4.95, P=0.054;S期：F=0.906, P=0.453；G2/M期：F=29.301,P=0.001），細(xì)胞周期受到阻滯，見圖3。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

與對照組相比，敲低EN2表達(dá)的肝癌細(xì)胞凋亡率明顯升高（F=221.807, P=0.000），見圖4。說明敲低EN2可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

2.5 細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、PTEN及Cyclin B1蛋白檢測結(jié)果

與對照組相比，敲低EN2表達(dá)的肝癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和PTEN蛋白水平明顯升高，Cyclin B1蛋白水平明顯降低（Cleaved Caspase-3: F=54.177, P=0.000; Cleaved Caspase-9: F=128.368, P=0.000; PTEN: F=17.299,P=0.003; Cyclin B1: F=19.500, P=0.002），見圖5。敲低EN2可以影響肝癌細(xì)胞中凋亡蛋白、周期蛋白及PTEN蛋白表達(dá)。

圖1 EN2 siRNA慢病毒感染后肝癌細(xì)胞中EN2 mRNA(A)和蛋白(B~C)表達(dá)變化Figure1 EN2 mRNA(A) and protein(B-C) expression in hepatocellular carcinoma cells after EN2 siRNA lentivirus infection determined by Western blot

圖3 各組肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期分布變化Figure 3 Cell cycle distribution of liver cancer cells in each group

2.6 線粒體膜電位和胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白檢測結(jié)果

敲低EN2后肝癌細(xì)胞胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平明顯升高（F=31.371, P=0.001），線粒體膜電位明顯降低（F=17.966, P=0.003），見圖6。敲低EN2可以降低肝癌細(xì)胞線粒體膜電位，提高胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平。

3 討論

人類的EN2基因可以編碼333個氨基酸，其定位于7q36染色體上，EN2蛋白包括5個功能較為保守的亞區(qū)，按照N端到C端依次命名為EH1~EH5，EH4為同源結(jié)構(gòu)區(qū)域，具有調(diào)控EN2蛋白的攝取及分泌作用，EH1、EH5能夠抑制EN2蛋白的促轉(zhuǎn)錄作用，EH2、EH3調(diào)控EN2蛋白同DNA的親和能力[7-9]。目前研究報道表明，EN2在胚胎發(fā)育、細(xì)胞惡性增殖等過程中具有重要作用，其表達(dá)水平的高低與腫瘤發(fā)生有關(guān)[10-11]。在人類膀胱癌中的研究表明，沉默EN2表達(dá)可以降低膀胱癌細(xì)胞的增殖能力，同樣在胃癌、腎癌等腫瘤細(xì)胞中得到證實[9,12-14]。本實驗結(jié)果顯示，敲低EN2的肝癌細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡增多，G2/M期細(xì)胞比例升高，敲低EN2具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，EN2在肝癌中可能發(fā)揮促進(jìn)作用。

圖5 敲低EN2對肝癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、PTEN及Cyclin B1蛋白水平的影響Figure5 Effect of EN2 knockdown on Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-9, PTEN and Cyclin B1 protein levels in hepatocellular carcinoma cells detected by Western blot

細(xì)胞周期進(jìn)程是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，細(xì)胞周期進(jìn)程與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其中G2期是細(xì)胞周期進(jìn)程中的檢查點，Cyclin B1是調(diào)控G2期的周期相關(guān)蛋白，其可以通過促進(jìn)周期相關(guān)蛋白復(fù)合物的形成促使細(xì)胞完成G2/M期的轉(zhuǎn)變[15-16]。EN2具有調(diào)控細(xì)胞周期的作用，沉默EN2表達(dá)可以將腎小管上皮細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，在正常乳腺細(xì)胞中的研究也顯示，高表達(dá)EN2可以縮短細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞快速增殖[17-18]。本實驗的結(jié)果表明，敲低EN2后的肝癌細(xì)胞G2/M期比例升高，細(xì)胞中Cyclin B1蛋白水平降低，敲低EN2可以通過調(diào)控周期蛋白的表達(dá)阻滯肝癌細(xì)胞周期。

圖4 敲低EN2后肝癌細(xì)胞凋亡的變化Figure 4 Apoptosis of hepatocellular carcinoma cells after knocking down EN2 detected by fl ow cytometry

圖6 敲低EN2對肝癌細(xì)胞胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白表達(dá)和線粒體膜電位的影響Figure6 Effect of EN2 knockdown on Cytochrome C protein expression and mitochondrial membrane potential in hepatocellular carcinoma cells

腫瘤細(xì)胞惡性增殖的同時凋亡水平降低，腫瘤細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞內(nèi)的Caspase蛋白家族有關(guān)，Caspase蛋白家族是廣泛存在于多種細(xì)胞中的凋亡調(diào)控因子，含有多個成員，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮促進(jìn)作用，Caspase-3活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志，Caspase-9活化增多是Caspase凋亡反應(yīng)的標(biāo)志[19-20]。Caspase-9參與細(xì)胞線粒體凋亡途徑，可以被胞質(zhì)中的Cytochrome C激活，正常情況下的Cytochrome C多存在于線粒體中，只有受到病理或生理因素刺激以后，線粒體膜電位降低，線粒體內(nèi)的Cytochrome C才可以被釋放到胞質(zhì)中，發(fā)揮凋亡促進(jìn)的作用[21-22]。本實驗的結(jié)果顯示，敲低EN2表達(dá)可以促進(jìn)Caspase-3和Caspase-9活化，降低線粒體膜電位，提高胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平，敲低EN2可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

本實驗還顯示，敲低EN2可以提高肝癌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平，從而影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。PTEN是一種抑癌基因，具有影響腫瘤浸潤、生長、骨架蛋白組裝等作用，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[23]。有研究報道顯示，外源性的PTEN可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡并阻滯細(xì)胞周期，并且對于不同的細(xì)胞周期阻滯作用不同，PTEN誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用機(jī)制與影響線粒體中Cytochrome C的釋放有關(guān)[24-26]。本實驗提示敲低EN2能夠通過PTEN介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)生，為以后研究肝癌的發(fā)病機(jī)制提供了基礎(chǔ)，而對于其具體的作用機(jī)制尚未驗證，我們將會在以后的實驗中進(jìn)行探討。