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        miR-127在肺癌中的表達及功能

        2019-05-06 01:06:48李建波江文凜樊漢利
        腫瘤防治研究 2019年4期
        關(guān)鍵詞:孔板克隆肺癌

        李建波,江文凜,樊漢利

        0 引言

        肺癌的發(fā)病率及死亡率在所有惡性腫瘤中排名第一[1],目前我國肺癌發(fā)病率及死亡率呈逐年升高趨勢,嚴重威脅國民健康[2]。早期肺癌的治療仍以手術(shù)為主,但對于晚期肺癌患者,五年生存率僅有大約4%。因此對肺癌的早期診斷和治療顯得尤為重要。目前越來越多的證據(jù)證明非編碼RNA,如mircoRNA,靶向作用于目標基因mRNA,引發(fā)目標mRNA的降解,從而調(diào)節(jié)致癌基因和抑癌基因的蛋白表達[3-5]。很多研究顯示,miRNA參與肺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[6-8]。

        人類miR-127基因位于染色體14q32.31的一個包括miR-136、miR-431、miR-432、miR-433、miR-337和miR-665的miRNA族,位于Dlk/Gtl2的印跡區(qū)域,反方向轉(zhuǎn)錄為Rtl1基因。人類miR-127基因前體可以表達兩個成熟的miRNA,miR-127-3p和miR-127-5p[9]。近年來有學(xué)者開始研究miR-127在腫瘤中的作用,如Bier等[10]的研究表明miR-127在神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌中表達下調(diào)。Chen等[11]發(fā)現(xiàn)胃癌細胞系miR-127高表達后抑制細胞增殖、細胞周期進程、細胞的遷移和侵襲。吳新華等[12]研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌miR-127低表達,宮頸癌組織miR-127表達檢測有助于預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和患者預(yù)后。然而miR-127在肺癌中的作用還未見報道,因此本文旨在研究miR-127在肺癌中的表達及其對肺癌細胞生物學(xué)特性的影響。

        1 資料與方法

        1.1 組織標本與細胞

        本次研究組織標本來自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢市普愛醫(yī)院2012年1月至2018年1月的20例肺癌患者的癌組織及其相應(yīng)癌旁組織,其中男12例、女8例,年齡43~78歲(62.3±7.45)歲,其中腺癌7例、 鱗癌 13例;病理分期為Ⅰ期7例、Ⅱ期5例、Ⅲ期4例、Ⅳ期4例。肺癌細胞株A549購自中國科學(xué)院上海細胞庫,采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(購自美國Hyclone公司),胎牛血清購自美國Gibco公司。

        1.2 實時熒光定量PCR測定各組miR-127含量

        采用試劑盒提取肺癌組及癌旁組織組中的總RNA,用實時熒光定量PCR法測定各組miR-127表達量,內(nèi)參使用GAPDH進行標準化。

        1.3 肺癌細胞株轉(zhuǎn)染實驗

        對數(shù)生長期的A549細胞接種于6孔板,待細胞密度融合為60%~70%時將細胞分為兩組:miR-127 mimics組及空白載體轉(zhuǎn)染組(negative control, NC),分別進行miR-127 mimics及空白載體轉(zhuǎn)染,細胞轉(zhuǎn)染用Lipofectamine2000,具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑說明書。轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞內(nèi)RNA檢測miR-127表達水平。

        1.4 細胞克隆形成實驗

        取miR-127 mimics及NC組的A549細胞,以1000個/孔接種于6孔板,細胞培養(yǎng)箱溫育1~3周,待細胞克隆形成,使用4%多聚甲醛固定細胞,0.1%結(jié)晶紫對細胞群落進行染色,計集落數(shù)。

        1.5 MTT法檢測A549細胞增殖活性

        取miR-127 mimics及空白載體轉(zhuǎn)染的A549細胞,以3 000個/孔接種于96孔板培養(yǎng),實驗結(jié)束前4 h加入5 mg/ml的MTT 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液,各孔加入DMSO 150 μl,室溫振蕩10 min,于酶標儀490 nm 波長處測定吸光度(OD)值。

        1.6 Transwell實驗檢測腫瘤細胞侵襲

        將Transwell小室置于24孔板后,加入miR-127 mimics和空白載體轉(zhuǎn)染組細胞,小室內(nèi)加入200 ml無血清培養(yǎng)基,24孔板內(nèi)加入600 ml血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室,擦除未通過小室濾膜的細胞,采用0.1%結(jié)晶紫對遷移細胞進行染色、漂洗、固定,任取鏡下5個視野進行計數(shù),每組實驗重復(fù)3次觀察其遷移情況。

        1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,研究資料數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,各組數(shù)值用均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組比較采用t檢驗。方法,多組比較使用方差分析,組內(nèi)兩兩比較使用LSD檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 miR-127在肺癌及癌旁組織中的表達

        miR-127在肺癌組織(0.55±0.05)中的表達水平顯著低于癌旁組織(1.45±0.13),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001),提示miR-127可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān),見圖1。

        圖1 miR-127在肺癌組織及癌旁組織中的表達Figure1 Expression of miR-127 in lung cancer tissues and adjacent normal tissues

        2.2 miR-127的表達與肺癌病理分期的關(guān)系

        病理分期為Ⅰ期的miR-127的表達處于較高水平,Ⅱ期、Ⅲ期肺癌組織的miR-127表達相對低分期組而言表達較低,Ⅳ期肺癌組織表達水平最低,統(tǒng)計分析顯示miR-127的表達水平與病理分期呈正相關(guān)(H=6.528, P=0.034),見圖2。

        2.3 miR-127 mimics轉(zhuǎn)染A549細胞

        圖2 miR-127的表達與肺癌病理分期的關(guān)系Figure2 Relationship between miR-127 expression and pathological stage of lung cancer

        將miR-127 mimics組、NC組進行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)48 h后提取RNA檢測,miR-127的表達水平結(jié)果顯示miR-127 mimics組顯著高于NC組(P=0.0001),見圖3。

        圖3 miR-127 mimics轉(zhuǎn)染A549細胞后miR-127的表達水平Figure3 Expression of miR-127 in A549 cells after miR-127 mimics transfection

        2.4 MTT法檢測miR-127對A549細胞增殖的影響

        miR-127 mimics轉(zhuǎn)染后48 h,用MTT法檢測A549細胞miR-127 mimics組和NC組中肺癌細胞的增殖,結(jié)果顯示miR-127 mimics轉(zhuǎn)染顯著抑制肺癌細胞的增殖,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0045),見圖4。此外,平板克隆形成實驗表明,與NC組相比,miR-127 mimics組中的肺癌細胞A549的集落形成效率顯著降低,見圖5。

        圖4 MTT法檢測miR-127對A549細胞的增殖Figure4 Proliferation of A549 cells after miR-127 mimics transfection detected by MTT assay

        2.5 Transwell實驗檢測miR-127對肺癌A549細胞遷移能力的影響

        采用Transwell實驗觀察miR-127 mimics組和NC組肺癌A549細胞的過膜數(shù)量,miR-127 mimics組(79±18個/視野)明顯低于NC組(352±21個/視野),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002),見圖6。

        3 討論

        圖5 平板克隆形成實驗檢測肺癌細胞A549的集落形成情況Figure5 Colony formation of A549 cells detected by cell colony formation assay

        圖6 Transwell實驗檢測miR-127 mimics轉(zhuǎn)染A549細胞的遷移能力Figure6 Migration ability of A549 cells after miR-127 mimics transfection detected by Transwell assay

        肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一,其臨床死亡率呈逐年上升趨勢[1]。早期肺癌的治療仍以手術(shù)切除為主,但由于肺癌早期癥狀不明顯,大多患者就診時已屬中晚期,且因腫瘤細胞局部浸潤和遠端轉(zhuǎn)移,患者失去根治性手術(shù)的機會,而且高復(fù)發(fā)率也是造成肺癌預(yù)后不理想的原因之一[13]。因此,早期診斷和治療是保障肺癌患者良好預(yù)后的關(guān)鍵因素。尋找肺癌早期診斷標志物對及時診治肺癌具有重要意義。近年來microRNA以其在生物學(xué)過程中多樣化的調(diào)節(jié)作用而備受關(guān)注[14-15]。各種腫瘤異常的microRNA表達譜為我們研究腫瘤發(fā)生提供了新的思路。

        miR-127作為mircoRNA中的一員,其在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到主要的作用。miR-127最早在胃癌、惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌中發(fā)現(xiàn),后來逐漸發(fā)現(xiàn)miR-127在卵巢癌、惡性膠質(zhì)瘤、肺癌、直腸癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤中起到腫瘤抑制的作用[9-12],然而miR-127在肺癌的發(fā)生發(fā)展中究竟起著什么樣的作用,尚不清楚。本研究收集肺癌及癌旁組織標本,并提取標本的miR-127表達量進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-127在肺癌組織中表達量明顯低于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對收集到的肺癌組織以病理分級進行分組,比較不同病理分級的肺癌組織中miR-127的表達情況,研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中miR-127的表達量隨著病理分級的惡性程度的增高而降低, Ⅳ期中miR-127表達量最低。miR-127在不同病理級別的肺癌組織中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示miR-127的表達可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)?;谝陨涎芯拷Y(jié)果,我們成功使用miR-127 mimics轉(zhuǎn)染A549細胞株,并進一步對轉(zhuǎn)染細胞進行了MTT、克隆形成實驗及Transwell實驗。MTT實驗結(jié)果顯示miR-127 mimics轉(zhuǎn)染顯著抑制肺癌細胞的增殖,克隆形成實驗表明,與NC組相比, miR-127 mimics組中的肺癌細胞A549的集落形成效率顯著降低。Transwell實驗結(jié)果顯示與NC組相比,miR-127 mimics組的細胞過膜數(shù)量減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Transwell實驗結(jié)果驗證了miR-127的表達水平與肺癌細胞的遷移能力相關(guān),miR-127的表達量增多可以抑制肺癌細胞的增殖遷移能力。綜上所述,肺癌組織中miR-127的表達水平較正常組織低,隨著病理分級惡性程度的增高而降低,并且過表達miR-127以抑制肺癌細胞的增殖轉(zhuǎn)移,提示miR-127對肺癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用,并且與肺癌的增殖轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可作為肺癌的潛在臨床診治靶點,測定miR-127的表達量可以為早期診斷和治療肺癌提供新思路。

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