袁浩，李永平，蔣曉飛，徐衛(wèi)燕，陳進(jìn)宏，閔志均

0 引言

近年來，全球范圍內(nèi)甲狀腺癌發(fā)病率逐年增高。研究顯示：2013年中國(guó)甲狀腺癌新增發(fā)病人數(shù)為33 939例，與1990年相比增加了21 898例，標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率由1.25/10萬升至2.07/10萬，增加65.6%，而其中80%~90%為甲狀腺乳頭狀癌。與其他惡性腫瘤相比，甲狀腺癌術(shù)后預(yù)后相對(duì)較好，但是手術(shù)根治性切除后仍有20%~30%的患者出現(xiàn)遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)，且在復(fù)發(fā)的病例中還有部分病例出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。然而關(guān)于甲狀腺乳頭狀癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制目前并不明了。FoxM1基因是Forkheadbox（FOX）家族的一員，參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化，近年來研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中FoxM1基因出現(xiàn)高度表達(dá)。沃伯格效應(yīng)（Warburg effect）被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)顯著特征，即與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞攝取并消耗大量的葡萄糖，即使在氧氣充足的條件下，糖酵解率和乳酸產(chǎn)量也會(huì)大大增加[2-5]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤中，F(xiàn)oxM1基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞糖酵解密切相關(guān)。因此在本實(shí)驗(yàn)中，通過研究抑制FoxM1基因?qū)谞钕侔┘?xì)胞糖酵解的影響，探討其在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

小量質(zhì)粒抽提試劑盒和Trans2K PlusⅡDNA Marker購(gòu)自北京全式金生物公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；DNA引物合成、DNA測(cè)序、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS和胰蛋白酶Trypsin 0.25%EDTA購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；HET kit和JM109感受態(tài)購(gòu)自深圳百恩維生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和T4 DNA Ligase購(gòu)自美國(guó)NEB公司；Qiagen大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；TPC-1細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；Beta-Actin抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；兔抗小鼠FoxM1抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗小鼠Glut1抗體、兔抗小鼠HK1抗體和兔抗小鼠HK2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 pLVX-shRNA2-Puro-hFoxM1載體構(gòu)建、干擾效率篩選及慢病毒包裝

設(shè)計(jì)shRNA，在3’端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，合成shRNA片段。載體pLVX-shRNA2-puro用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ+BamHⅠ雙酶切，將回收大片段與shRNA-hFoxM1的稀釋退火產(chǎn)物連接，然后用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μl JM109感受態(tài)細(xì)胞。抽提質(zhì)粒，挑取酶切鑒定正確的陽(yáng)性菌測(cè)序。將篩選后干擾效率最佳的重組質(zhì)粒pLVX-shRNA2-puro-hFoxM1-1導(dǎo)入293T細(xì)胞，產(chǎn)生高滴度含目的基因的慢病毒（簡(jiǎn)稱慢病毒rLv-hFoxM1）。

1.3 慢病毒rLv-hFoxM1轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞后檢測(cè)FoxM1基因mRNA的表達(dá)

1.3.1 總RNA的提取 用rLv-hFoxM1（MOI=5）處理TPC-1細(xì)胞，并設(shè)定TPC-1細(xì)胞作為對(duì)照。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。使用TRIzol提取總RNA，檢測(cè)所得RNA的純度和完整性，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 cDNA模板的合成 將Oligo（dT）12~18（500 μg/ml）、總RNA、dNTP混合物在65℃加熱5 min，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后，加入以下組分：5×第一鏈合成緩沖液、0.1 mol/L DTT。然后在37℃下孵育2 min。在室溫下加入1 μl（200單位）M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，輕輕地吹打混勻。在70℃加熱15 min以終止反應(yīng)。cDNA產(chǎn)物直接作為qPCR的模板。

1.3.3 qPCR檢測(cè) 分別設(shè)計(jì)內(nèi)參beta-actin和目的基因hFoxM1擴(kuò)增引物。（1.3.1~1.3.3具體。方法見參考文獻(xiàn)[6]。）

1.4 慢病毒rLv-hFoxM1轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞后檢測(cè)FoxM1蛋白的表達(dá)

將慢病毒rLv-hFoxM1（滴度為1.0×108TU/ml）轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞，命名為TPC-1-shRNA-hFoxM1組，將未轉(zhuǎn)染慢病毒的TPC-1細(xì)胞作為對(duì)照，命名為TPC-1-control組，感染72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化并換成正常培養(yǎng)基，加入終濃度為10 μg/ml（經(jīng)梯度實(shí)驗(yàn)確定）嘌呤霉素進(jìn)行抗生素篩選。每隔2~3 d換1次終濃度為10 μg/ml的嘌呤霉素新鮮培養(yǎng)基。待對(duì)照細(xì)胞完全死亡后，擴(kuò)增存活細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。取部分細(xì)胞裂解提取蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加一抗4℃搖床孵育過夜，再加標(biāo)有熒光標(biāo)記的二抗室溫?fù)u床孵育1 h，應(yīng)用奧德賽雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)hFoxM1蛋白的表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參使用Western blot檢測(cè)hFoxM1蛋白表達(dá)水平。

1.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性

噻唑藍(lán)（MTT）比色法顯色深淺隨孔板中活細(xì)胞數(shù)增加而逐漸加深，其吸光值亦隨之升高。將對(duì)照組TPC-1細(xì)胞及慢病毒rLv-hFoxM1轉(zhuǎn)染的TPC-1細(xì)胞消化，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104/ml，以每孔200 μl接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)兩組（TPC-1-control組和TPC-1-shRNA-hFoxM1組），每組7個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后換用無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。于同步化之后24、48、72、96、120 h分別用MTT法測(cè)定細(xì)胞吸光度值（OD值）。

1.6 乳酸生產(chǎn)和葡萄糖利用分析

將TPC-1細(xì)胞（1×106）進(jìn)行慢病毒rLvhFoxM1轉(zhuǎn)染，將已轉(zhuǎn)染的TPC-1細(xì)胞放入培養(yǎng)基，孵育24 h，然后用無酚紅的無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（RPMI）+1%FBS+20 mmol/L草氨酸鈉代替培養(yǎng)基，持續(xù)孵育3天。每天收集標(biāo)本，用比色測(cè)定葡萄糖試劑盒（BioVision）測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度（生物視覺），并根據(jù)原始總量進(jìn)行間接定量計(jì)算出葡萄糖消耗量，最后根據(jù)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。同樣根據(jù)乳酸測(cè)定試劑盒的說明書（Sigma）進(jìn)行操作，測(cè)定乳酸產(chǎn)量。

1.7 糖酵解途徑關(guān)鍵酶測(cè)定

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁鋪滿后進(jìn)行干預(yù)處理，分別提取TPC-1-control組和TPC-1-shRNA-hFoxM1組總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白總濃度后，用Western blot法測(cè)定糖酵解途徑關(guān)鍵酶己糖激酶1（hexokinase isoform 1, HK1）、己糖激酶2 (hexokinase isoform 2, HK2)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白1（glucose transporter 1, Glut1）含量變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用One-way ANOVA檢驗(yàn)比較兩組細(xì)胞中FoxM1基因及蛋白水平的表達(dá)差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pLVX-shRNA2-puro-hFoxM1-1慢病毒包裝

將篩選后干擾效率最佳的重組質(zhì)粒pLVX-shRNA2-puro-hFoxM1-1導(dǎo)入293T細(xì)胞，產(chǎn)生了高滴度含目的基因的慢病毒（簡(jiǎn)稱慢病毒rLv-hFoxM1），測(cè)定rLV-hFoxM1滴度為：1.0×108TU/ml。

2.2 慢病毒rLv-hFoxM1轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞后檢測(cè)FoxM1蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相比TPC-1-control組，TPC-1-shRNA-hFoxM1組中，F(xiàn)oxM1蛋白的表達(dá)水平明顯降低，見圖1。

2.3 應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性

用MTT法測(cè)定細(xì)胞OD值，結(jié)果顯示，同步化之后24、48、72、96、120 h，與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組（TPC-1-control）相比，慢病毒rLv-hFoxM1干擾的TPC-1細(xì)胞（TPC-1-shRNA-hFoxM1組）OD值顯著降低（P=0.036），表明降低FoxM1基因表達(dá)可抑制TPC-1細(xì)胞的活性，見圖2。

2.4 乳酸生產(chǎn)和葡萄糖利用分析

將TPC-1細(xì)胞（1×106）進(jìn)行慢病毒rLvhFoxM1轉(zhuǎn)染，測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度及乳酸產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)抑制FoxM1基因后，其葡萄糖攝取降低，且同時(shí)乳酸生成也相應(yīng)減少，見圖3。

圖1 慢病毒rLv-hFoxM1干擾的TPC-1細(xì)胞中FoxM1蛋白的表達(dá)Figure1 FoxM1 expression in TPC-1 cells after rLvhFoxM1 transfection

圖2 MTT法檢測(cè)降低FoxM1基因表達(dá)對(duì)TPC-1細(xì)胞活性的影響Figure2 Effect of decreased FoxM1 gene expression on TPC-1 cell activity detected by MTT

2.5 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及糖酵解途徑關(guān)鍵酶測(cè)定

圖3 抑制FoxM1基因后對(duì)葡萄糖攝取及乳酸生成的影響Figure3 Effect of decreased FoxM1 gene expression on glucose uptake and lactic acid production

提取TPC1-control組和TPC-1-shRNA-hFoxM1組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白總濃度后，用Western blot法測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Glut1）及糖酵解途徑關(guān)鍵酶，發(fā)現(xiàn)抑制FoxM1基因后，其葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Glut1）、己糖激酶1（HK1）和己糖激酶（HK2）含量明顯降低，表明糖酵解途徑受到抑制，見圖4。

圖4 抑制FoxM1基因后葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及糖酵解途徑關(guān)鍵酶的測(cè)定Figure4 Determination of glucose transporter and key enzymes of glycolysis pathway after inhibition of FoxM1 gene expression

3 討論

目前對(duì)于調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)鍵分子研究一直是本領(lǐng)域熱點(diǎn)，對(duì)于預(yù)防治療術(shù)后轉(zhuǎn)移有著較高的轉(zhuǎn)化意義。大量研究證實(shí)FoxM1參與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移，F(xiàn)oxM1表達(dá)增加與腫瘤患者的臨床分型差、預(yù)后差有顯著相關(guān)性[7-10]。FoxM1基因在甲狀腺癌中的作用研究較少，Ahmed等研究發(fā)現(xiàn)中東地區(qū)甲狀腺乳頭狀癌患者中FoxM1基因高度表達(dá)，表明FoxM1異常表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生有關(guān)，且在高侵襲性的甲狀腺乳頭狀癌中比其他類型的甲狀腺乳頭狀癌更加明顯，這提示FoxM1基因參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[11-12]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-1中，用hFoxM1-RNA干擾FoxM1基因表達(dá)后，TPC-1細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯下降，說明FoxM1基因與甲狀腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。

另一方面，F(xiàn)oxM1基因參與調(diào)控甲狀腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制并不清楚。腫瘤細(xì)胞需要大量的葡萄糖來滿足能量的需要，腫瘤細(xì)胞中大部分葡萄糖通過糖酵解途徑代謝，Lynch等提出代謝途徑的改變可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[14-15]。Warburg教授團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)在氧氣充足的條件下，惡性腫瘤細(xì)胞主要采用無氧糖酵解途徑方式提供生命活動(dòng)所需的能量，而不是以生成能量更多的三羧酸循環(huán)途徑，這種異常的能量產(chǎn)生利用方式被稱為沃伯格效應(yīng)[2]，這代謝方式的改變被認(rèn)為是惡性腫瘤的重要特征之一[3-5]。最新研究顯示，在多種惡性腫瘤中，糖酵解水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力存在密切關(guān)系。胰腺癌中原發(fā)灶及不同部位的轉(zhuǎn)移灶中，糖酵解代謝相關(guān)的基因水平均有不同程度的升高，并且在轉(zhuǎn)移灶升高更為明顯[16-19]。同樣，甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系BCPAP和TPC1中發(fā)現(xiàn)乳酸水平明顯增強(qiáng)，且臨床研究中發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者其乳酸水平更進(jìn)一步增強(qiáng)[20-21]。

有研究發(fā)現(xiàn)FoxM1基因通過調(diào)控糖酵解途徑參與腫瘤的增殖分化以及轉(zhuǎn)移。FoxM1可以使腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境下存活，降低FoxM1表達(dá)將使缺氧的腫瘤細(xì)胞增殖能力受損[22]。在間充質(zhì)干細(xì)胞中，ERK/FoxM1通路的激活可以防止高糖誘導(dǎo)的干細(xì)胞衰老，也證明了FoxM1可以調(diào)控細(xì)胞的糖代謝[23]。最近的研究表明在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中，F(xiàn)oxM1通過增強(qiáng)高表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（GLUT1）來增強(qiáng)糖酵解途徑[24]；在上皮性卵巢癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中GLUT1和己糖激酶（HK）高度表達(dá)，與FoxM1基因上調(diào)具有高度相關(guān)性，提示FoxM1基因很有可能參與調(diào)控糖酵解途徑[25]。在胰腺癌中也發(fā)現(xiàn)FoxM1基因通過增強(qiáng)乳酸脫氫酶的表達(dá)來增強(qiáng)沃伯格效應(yīng)[26]。以上研究均表明FoxM1基因與糖酵解途徑存在密切聯(lián)系。在本研究中，使用甲狀腺乳頭狀癌TPC1細(xì)胞系，抑制其FoxM1基因表達(dá)后細(xì)胞的葡萄糖攝取明顯降低，且同時(shí)發(fā)現(xiàn)乳酸生成也相應(yīng)減少，這表明了FoxM1基因很可能參與糖酵解途徑的調(diào)控，但具體調(diào)控機(jī)制不明。因此我們繼續(xù)抑制FoxM1基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含量下降，同時(shí)糖酵解關(guān)鍵酶己糖激酶1（HK1）和己糖激酶（HK2）含量也明顯降低，這充分說明FoxM1參與了甲狀腺癌TPC1糖酵解途徑。

綜上，F(xiàn)oxM1基因與甲狀腺癌的增殖分化以及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且很有可能通過糖酵解途徑來實(shí)現(xiàn)。但FoxM1基因如何通過糖酵解途徑來調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移還需進(jìn)一步的研究，這一研究也將是對(duì)甲狀腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的一個(gè)補(bǔ)充。