堵正潔 沈珍賢

1 無(wú)錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院 (無(wú)錫 214151)2 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫精神衛(wèi)生中心 (無(wú)錫 214151)

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，我國(guó)心血管疾病患病率及死亡率處于上升趨勢(shì)[1]。研究表明，心血管疾病的發(fā)生發(fā)展與血脂異常密切相關(guān)[2]。血脂異常是脂質(zhì)代謝紊亂、轉(zhuǎn)運(yùn)異常的表現(xiàn)，包括血清總膽固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高，以及血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低[3]。阿托伐他汀屬于羥甲基戊二酸輔酶A還原酶抑制劑，目前在臨床上廣泛用于降脂和穩(wěn)定動(dòng)脈硬化斑塊治療[4]。阿托伐他汀在體內(nèi)主要通過(guò)抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶來(lái)抑制膽固醇的合成，從而使血漿TC、TG、LDL-C水平降低，同時(shí)使HDL-C水平輕度升高。然而，不同患者之間阿托伐他汀調(diào)脂療效差異較大[5]，有研究表明，阿托伐他汀是ATP結(jié)合盒亞家族B(MDR / TAP)成員1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1,ABCB1)的基因表達(dá)產(chǎn)物——P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)底物[6]。在已發(fā)現(xiàn)的ABCB1的近50個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)中，外顯子26的C3435T和外顯子21的G2677T/A 均能夠影響P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，很可能致阿托伐他汀療效的個(gè)體化差異出現(xiàn)[7]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于ABCB1基因SNPs與血脂異常及調(diào)脂療效相關(guān)性研究比較少，故本研究率先從臨床的角度出發(fā)，初步探討了ABCB1基因G2677T、C3435T多態(tài)性與阿托伐他汀降脂療效的關(guān)系，為今后臨床的個(gè)體化降脂治療方案的制訂提供了依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2014年1月—2016年1月收集無(wú)錫市精神衛(wèi)生中心血脂異常住院患者，受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2007年中國(guó)成人血脂異常防治指南[8]，患者血脂水平至少符合一項(xiàng)以下血脂參照標(biāo)準(zhǔn)，TC≥5.18 mmol/L，TG≥1.70 mmol/L，LDL-C≥3.37 mmol/L，HDL-C≤1.04 mmol/L；①研究前2周未服用過(guò)各類(lèi)降脂相關(guān)藥物；②研究前2周未服用過(guò)影響血脂水平及影響阿托伐他汀代謝的藥物。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有繼發(fā)性血脂異常、活動(dòng)性肝病、嚴(yán)重腎功能不全、對(duì)阿托伐他汀中任何成分過(guò)敏、嚴(yán)重創(chuàng)傷或重大手術(shù)者；②孕婦或可能受孕的育齡女性；③哺乳期婦女；④吸煙飲酒患者。

共收集205例漢族患者，其中男127例，女78例，年齡24～94歲，平均(65.65±13.65)歲，病程3～24個(gè)月，平均(13.10±6.02)個(gè)月。

1.2 試劑與儀器

氯仿、異丙醇、乙醇等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，使用時(shí)按需要配制。Reveres Transcription PCR相關(guān)試劑：焦炭酸二乙酯(DEPC)、Trizol RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Taq聚合酶、100 bp DNA Ladder、瓊脂糖均購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司。PCR引物設(shè)計(jì)，該實(shí)驗(yàn)采用的引物均為GenBank 獲取cDNA 全序列后，均由上海Invitrogen公司合成。

垂直電泳槽與 Gel DOC 2000 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-RAD 公司),PCR擴(kuò)增儀(德國(guó) Eppendorf 公司),全自動(dòng)紫外分光光度計(jì)Du640(美國(guó)Beekman公司)，高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司),羅氏全自動(dòng)血生化分析儀Modlar P800(德國(guó)羅氏公司)。

1.3 治療方法與分組

患者均單一服用阿托伐他汀鈣膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字H20051984，10 mg/片，天方藥業(yè)有限公司)20 mg每天，連續(xù)服用3個(gè)月。服藥期間的3個(gè)月除阿托伐他汀外均未服用過(guò)其他影響血脂水平及其代謝的藥物，無(wú)冠心病、高血壓病史、糖尿病，心電圖檢查均正常。治療3個(gè)月后均進(jìn)行4項(xiàng)血脂指標(biāo)檢測(cè)。將205例患者治療3個(gè)月后4項(xiàng)指標(biāo)TC、TG、LDL-C、HDL-C恢復(fù)正常分為A組，治療后4項(xiàng)指標(biāo)仍有一項(xiàng)及一項(xiàng)以上異常分為B組。

1.4 ABCB1基因分型

抽取外周靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝管中，-80℃保存。采用酚-氯仿法200 μL抽提DNA，紫外分光光度法測(cè)定各樣本DNA濃度。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP) 方法分析患者的基因分型。PCR引物序列為，ABCB1 G2677T正向引物：5′-AGTTTTCAGAAAATAGAAG CATGAGT-3′；反向引物：5′-GGGAGTAACAAAA TAACACTGATTAGA-3′。ABCB1 C3435T正向引物：5′-TGTGCTGGTCCTGAAGTT-3′；反向引物：5′-TAGGCAGTGACTCGATGAA-3′。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積50 μL，包含Ex Taq (5U/μL),10× Buffer 5 μL，dNTP Mixture (各2.5 mmol) 4 μL，模板DNA 2.5 ng，引物各1 μL；PCR反應(yīng)條件：ABCB1 G2677T：94 ℃預(yù)變性3min，94 ℃變性30s，61 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸7min，PCR產(chǎn)物片段351 bp。ABCB1 C3435T：94 ℃預(yù)變性3min，94 ℃變性40s，52.0 ℃退火 1min，72 ℃延伸 1min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸7min，PCR產(chǎn)物片段246 bp。酶切及電泳: 用NIaⅢ限制性內(nèi)切酶酶切，37 ℃ 4 h后以15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 患者的基本資料

對(duì)205例患者年齡、病程進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)符合正態(tài)分布。其中，A組患者130例，男80例、女50例，年齡32～94歲、平均(67.00±12.44)歲，病程3～23個(gè)月、平均(12.78±5.93)個(gè)月；B組患者75例，男47例、女28例，年齡24～91歲、平均(63.32±15.34)歲，病程3～24個(gè)月、平均(13.68±6.17)個(gè)月。兩組患者的年齡、病程比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1患者年齡和病程分布

表3A組和B組ABCB1基因G2677T、C3435T基因型和等位基因頻率

2.2 ABCB1基因G2677T、C3435T基因型及等位基因頻率分布

經(jīng)吻合度檢驗(yàn)，患者基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明樣本來(lái)自同一蒙德?tīng)柸后w，樣本具有代表性。205例患者中G2677T位點(diǎn)GG型、GT型、TT型基因頻率分別為19.51%、42.44%、38.05%；等位基因G和T頻率分別為40.73%和59.27%。C3435T位點(diǎn)CC型、CT型、TT型基因頻率分別為34.63%、49.76%、15.61%；等位基因C和T頻率分別為59.51%和40.49%。

G2677T位點(diǎn)A組與B組等位基因突變率為58.46%與60.67%，A組GG型、GT型、TT型基因頻率分別為23.08%、36.92%、40.00%，B組GG型、GT型、TT型基因頻率分別為13.33%、52.00%、34.67%；C3435T位點(diǎn)A組與B組等位基因突變率為40.77%和40.00%，A組CC型、CT型、TT型基因頻率分別為34.62%、 49.23%、16.15%，B組CC型、CT型、TT型基因頻率分別為34.67%、50.67%、14.66%。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，A組和B組患者ABCB1基因G2677T、C3435T基因型和等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2～3。

表2患者基因型分布(G2677T、C3435T)

2.3 用藥前ABCB1基因G2677T、C3435T多態(tài)性與4項(xiàng)血脂指標(biāo)的關(guān)系

對(duì)205例患者用藥前4項(xiàng)血脂指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TG、TC、HDL-C、LDL-C經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后符合正態(tài)分布。服藥前，基因G2677T各基因型患者血漿TG、HDL-C水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TT型患者血漿TC、LDL-C水平高于GT型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而GG型患者TC、LDL-C水平與分別與GT、TT型患者比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；駽3435T各基因型患者血漿TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)見(jiàn)表4。

表4阿托伐他汀治療前ABCB1 G2677T、C3435T不同基因型間血脂水平比較(M±Q)

與GT型患者比較：#P<0.05

2.4 用藥后ABCB1基因G2677T、C3435T多態(tài)性與4項(xiàng)血脂指標(biāo)的關(guān)系

對(duì)205例患者用藥后4項(xiàng)血脂指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用藥后TG、TC、HDL-C、LDL-C經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后符合正態(tài)分布。服藥后，基因G2677T各基因型患者血漿TG水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GT型患者血漿TC、HDL-C、 LDL-C水平低于GG型和TT型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而GG型與TT型患者TC、HDL-C、LDL-C水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。基因C3435T各基因型患者血漿TG、HDL-C水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)；TT型患者血漿TC水平低于CC型和CT型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CC型與CT型患者TC水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TT型患者血漿LDL-C水平低于CC型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CT型患者LDL-C水平分別于CC型、TT型比較無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5阿托伐他汀治療后ABCB1 G2677T、C3435T不同基因型間血脂水平比較(M±Q)

與GG、TT型患者比較：*P<0.05；與CC、CT型患者比較：#P<0.05；與CC型患者比較：**P<0.05

2.5 用藥前后4項(xiàng)血脂指標(biāo)的比較

對(duì)阿托伐他汀用藥前后4項(xiàng)血脂水平的差值進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用藥前后血漿TC、HDL-C、LDL-C水平的差值服從正態(tài)分布，而TG用藥前后的差值經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后也達(dá)到正態(tài)分布。與用藥前相比，用藥后血漿TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，與用藥前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。對(duì)于TG指標(biāo)，由于其用藥前后差值不符合正態(tài)分布，經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后達(dá)到正態(tài)分布后進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，用藥前Ln(TG)水平(0.42±0.51)高于用藥后Ln(TG)水平(0.23±0.36)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表6。

表6 阿托伐他汀治療前后4項(xiàng)血脂水平比較(M±Q)

血脂指標(biāo)用藥前用藥后PTG/(mmol/L)1.46±1.211.31±0.56#<0.001TC/(mmol/L)3.70±2.073.62±1.28#<0.001HDL-C/(mmol/L)0.82±0.291.09±0.16#<0.001LDL-C/(mmol/L)1.89±1.381.90±0.96#<0.001

與用藥前比較：#P<0.05

2.6 ABCB1基因G2677T、C3435T位點(diǎn)多態(tài)性與阿托伐他汀調(diào)脂療效的關(guān)系

ABCB1基因G2677T、C3435T各基因型患者血脂水平差值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表7。

表7ABCB1 G2677T、C3435T不同基因型間阿托伐他汀用藥前后血脂水平差值比較

▲血脂水平用M±Q表示

3 討 論

本研究探討了阿托伐他汀的主要代謝酶ABCB1基因 G2677T、C3435T多態(tài)性與阿托伐他汀降脂療效的關(guān)系。ABCB1基因(多藥耐藥基因，MDR1)編碼的P-gp位于肝細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞頂端及近端小管刷狀緣，其功能是將藥物由細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，防止藥物及其代謝產(chǎn)物積聚細(xì)胞內(nèi)引起毒性反應(yīng)。ABCB1基因突變將導(dǎo)致P-gp表達(dá)異?；蚬δ苋毕輀9]，影響藥物在體內(nèi)的代謝，導(dǎo)致阿托伐他汀不同的療效和不良反應(yīng)。

隨著藥物基因組學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)ABCB1基因在不同種族人群中至少超過(guò)50個(gè)SNPs，其中位于編碼區(qū)域的C1236T、G2677T/A和C3435T 在不同種族人群中均有報(bào)道，被認(rèn)為是影響ABCB1基因功能的3個(gè)最常見(jiàn)SNPs，具有重要意義。C1236T、G2677T/A、C3435T等位基因在中國(guó)人群的突變率較高，分別為71.9%(C1236T)、50%(G2677T)、12.5%(G2677A)和53.1%(C3435T)，且三者之間存在明顯的連鎖不平衡[10-14]。且有研究發(fā)現(xiàn)在女性高脂血癥患者中，ABCB1 3435C>T與阿托伐他汀的療效有關(guān)，服用阿托伐他汀后，CC基因型患者LDL-C下降最少，而各基因型HDL-C升高的幅度依次為CC>CT>TT[15]。臨床上已有ABCB1基因C1236T與阿托伐他汀調(diào)脂療效關(guān)系的研究，而本研究探討了ABCB1的另外兩個(gè)基因位點(diǎn)G2677T和C3435T的多態(tài)性與臨床阿托伐他汀對(duì)降脂的療效的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，ABCB1基因G2677T位點(diǎn)在治療后4項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)正常人群中等位基因突變率為58.46%，治療后4項(xiàng)指標(biāo)仍有一項(xiàng)及一項(xiàng)以上異常人群中等位基因突變率為60.67%；C3435T位點(diǎn)在治療后4項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)正常人群和仍有一項(xiàng)及一項(xiàng)以上異常人群中等位基因突變率為40.77%和40.00%；ABCB1基因G2677T、C3435T位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在治療后4項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)正常人群和仍有一項(xiàng)及一項(xiàng)以上異常人群中分布并無(wú)明顯差異。205例患者中，用藥前ABCB1基因G2677T位點(diǎn)TT型血漿TC、LDL-C水平高于GT型(P<0.05)。用藥后ABCB1基因G2677T位點(diǎn)GT型血漿TC、HDL-C、LDL-C水平低于GG型與TT型(P<0.05)；用藥后ABCB1基因C3435T位點(diǎn)TT型血漿TC水平低于CC與CT型(P<0.05)，而CC型血漿LDL-C水平高于TT型(P<0.05)；綜上所述ABCB1基因G2677T位點(diǎn)和C3435T位點(diǎn)SNPs與血脂水平有關(guān)，可為臨床治療提供依據(jù)。經(jīng)20 mg/d阿托伐他汀治療3個(gè)月后，血漿TG、TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，說(shuō)明阿托伐他汀具有良好的降血脂效果。而治療前后4項(xiàng)指標(biāo)的差值與ABCB1基因G2677T、C3435T位點(diǎn)SNPs無(wú)關(guān)，說(shuō)明ABCB1基因G2677T位點(diǎn)和C3435T位點(diǎn)SNPs可能與阿托伐他汀降脂療效無(wú)關(guān)。

目前，大部分有關(guān)基因多態(tài)性對(duì)他汀類(lèi)藥物影響的研究，都只考慮某一種多態(tài)性對(duì)他汀類(lèi)藥物的影響，而他汀類(lèi)藥物在體內(nèi)的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、產(chǎn)生藥效的過(guò)程十分復(fù)雜，影響因素眾多，單個(gè)遺傳決定因素難以全面反應(yīng)多態(tài)性所致影響，同時(shí)考慮多個(gè)基因聯(lián)合效應(yīng)更具現(xiàn)實(shí)意義[16]。阿托伐他汀的藥物基因組學(xué)研究是目前冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化治療領(lǐng)域中的新進(jìn)展，有關(guān)藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體以及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因多態(tài)性對(duì)阿托伐他汀藥物療效的影響，國(guó)內(nèi)外已有很多研究，但其仍處于一個(gè)起步階段，缺乏多個(gè)基因位點(diǎn)的單倍體研究，對(duì)于突變位點(diǎn)的功能意義研究尚需完善，缺乏多人種、多種族的大樣本研究，缺乏藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體與代謝酶對(duì)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)影響的聯(lián)合研究[17]。有報(bào)道研究發(fā)現(xiàn)影響阿托伐他汀降脂效果的可能機(jī)制較多，并且除ABCB1 G2677T和C3435T多態(tài)性之外，其它位點(diǎn)的多態(tài)性也可能影響阿托伐他汀的降脂效果；而且同一基因不同位點(diǎn)的SNPs之間存在很多連鎖關(guān)系，單一位點(diǎn)的SNPs可能本身并不改變編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)而是通過(guò)與臨近的或潛在的與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的SNPs連鎖共同起作用[18]。有些因素如環(huán)境、藥物、飲食、運(yùn)動(dòng)之間相互作用等，也可能會(huì)影響血脂水平。

本研究并未測(cè)定患者血藥濃度，無(wú)法進(jìn)一步分析結(jié)果；而且本研究只檢測(cè)了總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)4個(gè)指標(biāo)，尚有其他血脂指標(biāo)未進(jìn)行檢測(cè)分析。所以本研究后期可以通過(guò)完善實(shí)驗(yàn)方法，增加SNPs研究位點(diǎn)并分析相互之間連鎖關(guān)系，增加血脂指標(biāo)檢測(cè)，盡可能消除影響因素，提高實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)性、嚴(yán)謹(jǐn)性與合理性，進(jìn)一步研究ABCB1基因G2677T、C3435T位點(diǎn)SNPs與血脂水平和阿托伐他汀調(diào)脂療效的相關(guān)性，從而為個(gè)體化治療提供臨床依據(jù)。隨著新技術(shù)及新研究方法的不斷改進(jìn)完善，相信在不久的將來(lái)，阿托伐他汀的個(gè)體化降脂治療會(huì)更加完善。