李曉麗，陳計(jì)巒，范盈盈，何偉忠，王 智，劉峰娟,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，新疆 烏魯木齊 830091；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（烏魯木齊），新疆 烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091；4.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

目前，新疆吐魯番地區(qū)已成為中國最大的葡萄干加工生產(chǎn)基地，該地區(qū)的綠葡萄干已成為中國葡萄干的特色產(chǎn)品并享譽(yù)全球[1]。生產(chǎn)綠葡萄干的主要葡萄品種為無核白葡萄，而無核白葡萄在脫水干制過程中極易發(fā)生褐變，嚴(yán)重影響了葡萄干的品質(zhì)[2-3]。因此，干制褐變已成為制約無核白葡萄干產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的關(guān)鍵問題[4-5]。

褐變是果蔬及其制品在加工和貯藏的過程中，在內(nèi)、外因素的綜合作用下表面顏色發(fā)生改變的現(xiàn)象[6]。大多數(shù)研究認(rèn)為果蔬加工和貯藏過程中的褐變主要是酶促褐變[7-8]。酶促褐變是在氧氣存在的條件下多酚氧化酶催化酚類物質(zhì)向醌及其聚合物轉(zhuǎn)變的過程，反應(yīng)生成褐色素或黑色素，造成褐變現(xiàn)象[9-10]。無核白葡萄采后脫水干制過程中的褐變主要為酶促褐變[11-12]。酶促褐變的三大關(guān)鍵因素之一即為酚類物質(zhì)，目前關(guān)于葡萄中酚類物質(zhì)的研究主要集中在葡萄成熟過程及釀造過程中酚類物質(zhì)種類和含量的變化[13-14]、不同品種和不同產(chǎn)區(qū)葡萄中酚類物質(zhì)組成及其與抗氧化活性的關(guān)系等方面[15-17]。對(duì)于干制過程中葡萄酚類物質(zhì)種類和含量的變化及其與褐變的關(guān)系的研究還相對(duì)較少。無核白葡萄采后干制過程中，在很長一段時(shí)間內(nèi)仍然保持著生命活力，對(duì)脫水脅迫仍能做出一定的反應(yīng)，也會(huì)通過一系列代謝來適應(yīng)這種脅迫。而這些改變很可能會(huì)對(duì)其次生代謝產(chǎn)物——酚類物質(zhì)產(chǎn)生影響，從而影響褐變的發(fā)生。

由于無核白葡萄中主要的酚類物質(zhì)以及這些酚類物質(zhì)如何參與酶促褐變等均未明確，為探討其在干制過程中酚類物質(zhì)的變化，本實(shí)驗(yàn)以無核白葡萄為研究對(duì)象，研究脫水干制過程中其酚類物質(zhì)組成的變化以及主要酚類物質(zhì)與多酚氧化酶的反應(yīng)，以期揭示無核白葡萄在采后脫水干制過程中酚類物質(zhì)的變化及其與褐變的關(guān)系，為提高無核白葡萄干品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無核白葡萄采自新疆吐魯番市。挑選成熟、無病蟲害、無損傷、大小均勻的果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料。葡萄果實(shí)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19%～22%，濕基水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（79.00±0.11）%，果實(shí)直徑為（11.17±0.45）mm，長度為（15.25±0.23）mm。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、甲醇、福林-肖卡試劑（均為分析純） 北京索萊寶科技有限公司；槲皮素、鄰羥基苯甲酸、咖啡酸、對(duì)羥基肉桂酸、原花青素B2、山柰酚、白藜蘆醇、異鼠李素、蘆丁、兒茶素、阿魏酸、楊梅素、香草酸（均為標(biāo)準(zhǔn)品） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SK2200H超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；全能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國賽默飛世爾公司；超高效液相色譜-離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ultra performance liquid chromatography-ion mobility quadrupole-time of flight mass spectrometer，UPLC-IMQTOF-MS） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將無核白葡萄置于陰涼干燥處，環(huán)境平均溫度為25 ℃，平均相對(duì)濕度45%，在無核白葡萄脫水質(zhì)量損失率[18]0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%時(shí)取樣，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 無核白葡萄褐變度的測(cè)定

取干質(zhì)量3 g無核白葡萄按料液比1∶10加蒸餾水，勻漿后在4 ℃下9 000 r/min離心30 min，褐變度以上清液在420 nm波長處的吸光度表示[19]。

1.3.3 酚類提取液制備

準(zhǔn)確稱取5.00 g不同質(zhì)量損失率的無核白葡萄，用30 mL酸化甲醇溶液在100 W、25 ℃條件下超聲輔助提取30 min，然后于9 000×g、4 ℃離心10 min，收集上清液，重復(fù)2 次，合并提取液。

1.3.4 總酚含量的測(cè)定

采用福林-肖卡法[20]，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y＝0.821x+0.070（R2＝0.994 8）。式中：x為沒食子酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）；y為沒食子酸含量/（mg/g）。結(jié)果以每克樣品中沒食子酸干質(zhì)量表示。

1.3.5 酚類物質(zhì)組成的測(cè)定

參照Kolniak-Ostek等[21]的方法，采用UPLC-IMQTOF-MS進(jìn)行酚類物質(zhì)單體測(cè)定。UPLC條件為：色譜柱采用UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相由溶劑A（體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）和溶劑B（乙腈）組成。梯度洗脫：0～1 min，99%溶劑A；1～12 min，99%～0%溶劑A；12～13.5 min，0%～99%溶劑A。流速0.45 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫45 ℃，進(jìn)樣室溫度10 ℃。質(zhì)譜條件為：毛細(xì)管電壓2 500 V，錐形電壓30 V，離子源溫度100 ℃，去溶劑化溫度300 ℃，脫溶劑氣體（氮?dú)猓┝魉?00 L/h，電壓斜坡循環(huán)0.3～2.0 V。對(duì)比自建數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性分析。

數(shù)據(jù)庫中酚類物質(zhì)包括：表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表?xiàng)攦翰杷?、棓兒茶素、兒茶酸沒食子酸酯、原花青素B2、原矢車菊素B2、咖啡酸乙酯、順式-白藜蘆醇、芹菜苷、黃岑苷元、安息香酸、咖啡酸、綠原酸、白楊素、肉桂酸、香豆酸、矢車菊素、花青素-3-葡萄糖苷、兒茶素、飛燕草素、二氫山柰酚、二氫槲皮素、二氫槲皮素-3-O-鼠李糖苷、圣草酸、香豆酸乙酯、沒食子酸乙酯、阿魏酸、沒食子酸、龍膽酸、橙皮苷、鄰羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸、金絲桃苷、異鼠李素、異槲皮素、異鼠李素-3-葡糖苷、山柰酚、山柰酚-3-葡糖苷、山柰酚-3-蕓香糖苷、錦葵素、錦葵花素-3-葡萄糖苷、二甲基花翠素葡萄糖苷、沒食子酸甲酯、沒食子酸甲酯-咖啡酸、楊梅素、楊梅酮-3-木糖苷、楊梅酮-3-鼠李糖苷、柚皮素、芍藥素、甲基花青素葡萄糖苷、矮牽牛素、對(duì)羥基苯甲酸、原花青素B1、柚皮苷、原矢車菊素B1、原矢車菊素B3、原兒茶酸、槲皮素、槲皮素-D-木糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-蕓香糖苷、反式-白藜蘆醇、鼠李黃素、蘆丁、水楊酸、介子酸、丁香亭-3-葡萄糖苷、丁香酸、反式-咖啡酸、香草酸。

1.3.6 酚類物質(zhì)分離與標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

利用UPLC-IM-QTOF-MS在無核白葡萄中鑒定到主要的14 種酚類物質(zhì)，通過標(biāo)準(zhǔn)品確定線性回歸方程，如表1所示。該檢測(cè)體系分離度、線性關(guān)系良好，R2均達(dá)到0.99以上。鑒定出的酚類物質(zhì)有槲皮素、鄰羥基苯甲酸、反式-咖啡酸、對(duì)羥基肉桂酸、原花青素B2、山柰酚、順式-白藜蘆醇、異鼠李素、蘆丁、兒茶素、阿魏酸、楊梅素、香草酸、山柰酚-3-葡萄糖苷。

表1 無核白葡萄中14 種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程Table 1 Linear regression equations for 14 phenolics standards of Thompson seedless grapes

1.3.7 無核白葡萄酶促褐變底物的鑒定

多酚氧化酶提?。簻?zhǔn)確稱取10.0 g無核白葡萄，加入18 mL 0.2 mol/L pH 5.8預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，用均質(zhì)機(jī)磨成勻漿，在4 ℃冰箱中浸提2.9 h，在4 ℃以9 000 r/min離心15 min，去除沉淀，取上清液，重復(fù)1 次，得到無核白葡萄多酚氧化酶提取液。

多酚氧化酶活力測(cè)定：在試管中加入3 mL 0.2 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液、1 mL 0.1 mol/L不同標(biāo)準(zhǔn)品（原花青素B2、山柰酚-3-葡糖苷、槲皮素、鄰羥基苯甲酸、山柰酚、對(duì)羥基肉桂酸、異鼠李素、蘆丁、兒茶素、順式-白藜蘆醇、阿魏酸、楊梅黃素、香草酸、反式-咖啡酸）溶液和1 mL多酚氧化酶提取液，混合均勻，在420 nm波長處測(cè)定其4 min內(nèi)的吸光度變化，每隔30 s測(cè)一次吸光度[22]，按下式計(jì)算酶活力。通過酚類物質(zhì)與多酚氧化酶是否發(fā)生反應(yīng)確定無核白葡萄酶促褐變底物。

式中：Vr為磷酸鹽緩沖液體積/mL；Vs為標(biāo)準(zhǔn)品溶液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g；t為測(cè)定時(shí)間/min；△A為4 min內(nèi)吸光度變化量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件作圖，并采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析，采用鄧肯氏多重比較法進(jìn)行差異分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 無核白葡萄干制過程中褐變度和總酚含量的變化

圖1 無核白葡萄在干制過程中褐變度（A）和總酚含量（B）的變化Fig. 1 Changes in browning degree (A) and total phenolic content (B)in Thompson seedless grapes during dehydration process

由圖1A可知，無核白葡萄在脫水過程中褐變度總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。褐變度在質(zhì)量損失50%～70%這一階段顯著增加（P＜0.05），隨著質(zhì)量損失率的增加，褐變程度越來越嚴(yán)重。在脫水結(jié)束時(shí)，無核白葡萄褐變度為0.297，為初始值的2.7 倍。由圖1B可知，無核白葡萄在脫水過程中總酚含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，無核白葡萄在質(zhì)量損失率40%～50%階段總酚含量顯著增加（P＜0.05），這與葡萄開始出現(xiàn)明顯褐變現(xiàn)象的時(shí)間相符。前人研究發(fā)現(xiàn)30 ℃熱風(fēng)干制第8天總酚含量突然增加，此時(shí)葡萄開始出現(xiàn)明顯褐變現(xiàn)象[23]，與本研究結(jié)果相同。

2.2 無核白葡萄干制過程中酚類物質(zhì)組成、含量的變化

表2 無核白葡萄干制過程中單體酚類物質(zhì)組成和含量Table 2 Loss of phenolic substances in Thompson seedless grapes during dehydration processμg/g

如表2所示，無核白葡萄脫水干制過程中原花青素B2、槲皮素、蘆丁含量整體呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，其中在鮮無核白葡萄中原花青素B2含量為37.57 μg/g，在脫水結(jié)束時(shí)只有10.24 μg/g，降低了72.74%，降低幅度最大。鄰羥基苯甲酸從最開始的0.37 μg/g降低至0.27 μg/g，降低速率最慢。山柰酚、對(duì)羥基肉桂酸、異鼠李素、阿魏酸、楊梅黃素、香草酸含量整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中山柰酚在鮮樣中的含量是1.09 μg/g，質(zhì)量損失率80%時(shí)增加了4.90 μg/g；阿魏酸含量上升最慢，從質(zhì)量損失率30%時(shí)的0.94 μg/g上升至1.36 μg/g，僅上升了0.42 μg/g。在質(zhì)量損失率50%時(shí)，原花青素B2、對(duì)羥基肉桂酸、兒茶素、順式-白藜蘆醇、阿魏酸、反式-咖啡酸含量突然升高后再下降，與無核白葡萄在質(zhì)量損失率50%時(shí)褐變度、總酚含量明顯上升的結(jié)果相符。楊梅黃素、香草酸分別在質(zhì)量損失率20%和40%時(shí)才開始出現(xiàn)，且其含量隨著質(zhì)量損失率的增加而增加，這是因?yàn)闂蠲伏S素和香草酸自身為淡黃色，隨著質(zhì)量不斷地?fù)p失，無核白葡萄褐變程度也在不斷加深，而楊梅黃素、香草酸含量不斷增加，加速了無核白葡萄表皮顏色的變化。

2.3 無核白葡萄多酚氧化酶底物鑒定

表3 無核白葡萄多酚氧化酶對(duì)不同底物催化褐變活性Table 3 Browning activity of polyphenol oxidase in Thompson seedless grapes to different substrates

不同植物所含的酚類物質(zhì)含量和種類各不同，參與褐變過程的主要酚類物質(zhì)也不同[21]。由表3可知，多酚氧化酶催化兒茶素褐變的酶活力是35.86 U/mL，是催化阿魏酸褐變的酶活力（1.24 U/mL）的28.92 倍（P＜0.05）。無核白葡萄多酚氧化酶對(duì)主要酚類物質(zhì)催化褐變的酶活力大小依次為：兒茶素＞反式-咖啡酸＞順式-白藜蘆醇＞對(duì)羥基肉桂酸＞原花青素B2＞阿魏酸，而無核白葡萄多酚氧化酶對(duì)山柰酚、山柰酚-3-葡糖苷、槲皮素、異鼠李素、蘆丁、鄰羥基苯甲酸、楊梅黃素和香草酸無反應(yīng)活性。說明無核白葡萄酶促褐變的底物主要是兒茶素，其次是反式-咖啡酸和順式-白藜蘆醇。

2.4 總酚及部分酚類物質(zhì)含量與褐變度間的相關(guān)性分析

表4 總酚及部分酚類物質(zhì)含量與褐變度之間的相關(guān)性Table 4 Correlation between total and individual phenolics contents and browning degree

由表4可知，無核白葡萄褐變度與總酚含量相關(guān)性最高，為-0.920；與阿魏酸含量相關(guān)性最小，為0.452。相關(guān)性由高到低為：總酚含量＞兒茶素含量＞反式-咖啡酸含量＞順式-白藜蘆醇含量＞對(duì)羥極肉桂酸含量＞原花青素B2含量＞阿魏酸含量。脫水干制過程中無核白葡萄褐變度與總酚含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與兒茶素含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；與反式-咖啡酸和順式-白藜蘆醇含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；與阿魏酸含量相關(guān)性不顯著。無核白葡萄脫水干制過程中，總酚、原花青素B2含量與褐變度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說明隨著干制時(shí)間的延長和褐變度的提高，總酚和原花青素B2含量在逐漸減少，總酚和原花青素B2參與酶促褐變的發(fā)生。

3 討 論

3.1 無核白葡萄酚類物質(zhì)組成特征

酚類物質(zhì)是葡萄中重要的次生代謝產(chǎn)物，與葡萄的抗病性、采后運(yùn)輸、貯存、保鮮及葡萄汁、葡萄酒的色澤、風(fēng)味、褐變等密切相關(guān)[24]。前人測(cè)定了無核白營養(yǎng)系W1、W2、W3、W5、W6、W7、W8和長粒無核白、長穗無核白、大粒無核白10 種不同營養(yǎng)系的無核白葡萄的酚類物質(zhì)組成，共檢測(cè)出19 種酚類物質(zhì)[17]，本研究中檢測(cè)出主要的14 種酚類物質(zhì)。同一品種葡萄不同種及處理方式不同會(huì)導(dǎo)致其酚類物質(zhì)組成、含量的差異。無核白葡萄果實(shí)中主要存在酚酸類、黃酮醇類、黃酮類、花色苷類物質(zhì)。本研究檢測(cè)到無核白葡萄中存在酚酸類5 種（反式-咖啡酸、阿魏酸、香草酸、鄰羥基苯甲酸、對(duì)羥基肉桂酸）、黃酮類6 種（兒茶素、原花青素B2、槲皮素、楊梅黃素、蘆丁、山柰酚）、黃酮糖苷類1 種（山柰酚-3-葡萄糖苷）、黃酮醇類1 種（異鼠李素）、芪類1 種（順式-白藜蘆醇）。驗(yàn)證了前人的結(jié)果，并進(jìn)一步證明了原花青素B2、兒茶素、山柰酚在無核白葡萄中含量較多。

3.2 葡萄干制過程中酚類物質(zhì)含量與褐變度的關(guān)系

褐變與酚類物質(zhì)密切相關(guān)[25-27]。Singleton等的研究證明無核白葡萄在曬干過程中咖啡酸消失，但是如果葡萄在室溫、遮光的條件下干燥，咖啡酸含量在最初一段時(shí)間內(nèi)基本保持不變，然后突然消失，同時(shí)葡萄開始褐變[28]。María等[29]在研究葡萄曬干過程中酚類物質(zhì)與褐變的關(guān)系時(shí)，認(rèn)為干燥過程中對(duì)羥基肉桂酸酯和黃烷-3-醇衍生物發(fā)生氧化降解是導(dǎo)致葡萄褐變的重要原因。Karadeniz等[30]也發(fā)現(xiàn)葡萄干多酚類成分中黃酮醇化合物對(duì)酶促褐變的反應(yīng)不如羥基肉桂酸化合物（肉桂酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸等）敏感，但在干制過程中原花青素和黃烷-3-醇類基本降解完全。Hogan等[31]認(rèn)為葡萄的褐變度與總酚、原花青素、兒茶素和根皮苷含量相關(guān)性較高。在本研究中，無核白葡萄主要酚類物質(zhì)中有6 種與多酚氧化酶發(fā)生反應(yīng)，即原花青素B2、對(duì)羥基肉桂酸、兒茶素、反式-咖啡酸、順式-白藜蘆醇、阿魏酸。在干制過程中的褐變度與總酚、原花青素B2、對(duì)羥基肉桂酸、兒茶素、反式-咖啡酸、順式-白藜蘆醇含量顯著相關(guān)，這與前人的研究結(jié)果有相同之處也有不同之處：相同之處為本研究中咖啡酸參與了酶促褐變，但是并未消失，只是含量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，羥基肉桂酸化合物（咖啡酸、阿魏酸）對(duì)酶促褐變較為敏感，且總酚、原花青素B2、兒茶素含量與褐變度相關(guān)性高；不同之處為無核白葡萄在干制過程中原花青素B2和黃酮類（兒茶素）未降解完全，且含量很高，這可能是葡萄品種和處理方式不同所致。本研究中發(fā)現(xiàn)無核白葡萄干制過程中出現(xiàn)明顯褐變現(xiàn)象時(shí)，這6 種酚類物質(zhì)含量都突然增加隨后減少，這與汪淼等[32]研究甘蔗莖尖在組織培養(yǎng)過程中褐變時(shí)酚類物質(zhì)的變化情況相同。說明酚類物質(zhì)在參與酶促褐變時(shí)會(huì)聚合產(chǎn)生較多的酚類單體，從而導(dǎo)致酶促褐變的發(fā)生。非酶促褐變是酚類物質(zhì)等在非酶促條件下被氧化而發(fā)生的顏色加深的現(xiàn)象[33]。無核白葡萄在干制過程中只有原花青素B2、槲皮素、蘆丁含量呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，而總酚含量減少了80%左右，說明酚類物質(zhì)可能部分參與了非酶促褐變，導(dǎo)致總酚含量急劇減少以及無核白葡萄干顏色的加深；也有可能是因?yàn)槊撍^程本身就是一種脅迫，為緩解脫水脅迫引起的膜脂過氧化、保護(hù)細(xì)胞膜免受或減少損傷導(dǎo)致總酚含量減少以起到保護(hù)作用[34]，具體原因需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上，本研究檢測(cè)到無核白葡萄中主要的酚類物質(zhì)有14 種，其中原花青素B2、對(duì)羥基肉桂酸、兒茶素、順式-白藜蘆醇、阿魏酸、反式-咖啡酸可作為酶促褐變的底物，除阿魏酸以外，其他5 種酚類物質(zhì)含量在無核白葡萄干制過程中與褐變度呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，說明這幾種酚類物質(zhì)與無核白葡萄干制過程中的酶促褐變密切相關(guān)。另外，實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的楊梅黃素、香草酸因其本身顏色淡黃，且隨著干制的進(jìn)行含量增加，推測(cè)這兩種酚類物質(zhì)在無核白葡萄干制褐變中也起到了一定的作用。本研究結(jié)果可為闡釋無核白葡萄干制過程中褐變機(jī)理以及提高無核白葡萄干品質(zhì)提供理論依據(jù)。