岳雪 王帥 李大成 王勇健 董惠鈞,*

(1 聊城大學(xué)藥學(xué)院，聊城 252000；2 聊城大學(xué)生物制藥研究院，聊城 252000)

野野村放線菌(Nonomuraeasp.ATCC39727)可以產(chǎn)生糖肽類抗生素達(dá)巴萬星前體A40926，經(jīng)酯化、酰胺化、水解和成鹽等步驟合成達(dá)巴萬星。達(dá)巴萬星主要用于治療革蘭陽性菌引起的皮膚和皮膚組織感染，抗菌活性優(yōu)于同類藥物萬古霉素和替考拉寧[1]。野野村放線菌基因組已測序完成，大小約11.85Mb，基因組上分布有33個次級代謝生物合成基因簇。糖肽抗生素達(dá)巴萬星前體A40926的合成基因簇dbv包含37個開發(fā)閱讀框(open read frame,ORF)，大小為71kb，指導(dǎo)氨基酸前體物先合成七肽骨架，經(jīng)環(huán)化和后修飾生成A40926[2]。

相對于高等動植物，微生物有著超強的環(huán)境適應(yīng)能力。微生物這種超強能力的遺傳基礎(chǔ)是其擁有復(fù)雜多樣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其中最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction system,TCS)。TCS目前只在細(xì)菌、古生菌和植物中有發(fā)現(xiàn)，而在人類和其他哺乳動物體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)。通常TCS系統(tǒng)由組氨酸激酶(histidine kinase,HK)和應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(response regulator,RR)構(gòu)成。HK中含有重復(fù)序列的N端胞外感受域和保守的C端胞內(nèi)傳導(dǎo)域(HisKA)，由N端胞外感受域感應(yīng)外界的特定環(huán)境刺激信號。RR通常包括一個保守的N端接受域和一個多變的C端輸出域(REC)組成，通過天冬氨酸殘基調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的一系列應(yīng)答反應(yīng)[3]。大多數(shù)細(xì)菌體內(nèi)都存在數(shù)量不等的TCS，它們調(diào)控細(xì)菌的趨化性、感知滲透壓、pH、金屬離子、形態(tài)分化、營養(yǎng)物質(zhì)代謝以及次級代謝產(chǎn)物的生物合成等諸多生理過程。

放線菌具有復(fù)雜的次級代謝產(chǎn)物和網(wǎng)絡(luò)。與之相對應(yīng)，放線菌中也具有豐富多樣的TCS系統(tǒng)，兩者之間息息相關(guān)。本文通過生物信息學(xué)方法對Nonomuraeasp.ATCC39727中TCS的分類、保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系以及功能進(jìn)行分析，旨在深入解析ATCC39727的生長和代謝相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控，為進(jìn)一步解析A40926合成代謝和調(diào)控，構(gòu)建高產(chǎn)工程菌株提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 ATCC39727基因組中雙組份信號系統(tǒng)預(yù)測和結(jié)構(gòu)功能分析

根據(jù)雙組份信號系統(tǒng)HK和RR蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析ATCC39727基因組中可能存在的雙組份系統(tǒng)。本文中ATCC39727基因組序列信息來自NCBI數(shù)據(jù)庫。ATCC39727雙組份信號系統(tǒng)的鑒定方法：(1)利用 Pfam 數(shù)據(jù)庫中保守的HK和RR結(jié)構(gòu)域HATPase_c(Pfam00512)和Response_reg(Pfam00072)對ATCC39727基因組進(jìn)行搜索比對，分別鑒定基因組中的HK和RR；(2)用NCBI的Blast P對得到的HK/RR序列進(jìn)行在線比對。

雙組份信號系統(tǒng)的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)：(1)HATPase結(jié)構(gòu)域應(yīng)該位于HK蛋白的C端；(2)HisKA位于HATPase 結(jié)構(gòu)域的前面，HATPase_c的上游具有二聚化或磷酸化結(jié)構(gòu)域DHp；(3)RR的N端含有磷酸受體，Response_reg結(jié)構(gòu)域位于RRs的C-末端。最后，參照 Williams和Whitworth的方法[4]對成對的TCS(HK-RR對)、融合HK和孤兒HK/RR進(jìn)行鑒定。如果HK和RR 位于同一操縱子上，則該HK和RR成功配對為成對 TCS；如果HisKA和REC結(jié)構(gòu)域同時出現(xiàn)在一個蛋白上，那么該蛋白定義為融合HK；如果HK/RR在同一操縱子上找不到對應(yīng)的RR/HK，則該HK/RR定義為孤兒HK/RR。

1.2 雙組份信號進(jìn)化樹和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別將ATCC39727基因組中所有HK和RR蛋白序列導(dǎo)入Mega 6.0軟件中，首先進(jìn)行Clustal W同源比對，然后選用NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹，并進(jìn)行Boot-strap驗證，重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1000。

利用Pfam、SMART和BLASTp進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，并用UniprotKB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行輔助驗證，結(jié)合文獻(xiàn)報道，預(yù)測TCS各組分的功能，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建ATCC39727 TCS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ATCC39727基因組中TCS分布

與其他微生物相比，放線菌具有復(fù)雜的形態(tài)分化和豐富的次級代謝網(wǎng)絡(luò)。與之相對應(yīng)，放線菌也含有豐富的TCS系統(tǒng)，與大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌平均25個成對TCS相比，天藍(lán)色鏈霉菌和野野村放線菌則分別含有67對和60對TCS(表1)。進(jìn)一步對比發(fā)現(xiàn)，野野村放線菌TCS系統(tǒng)中的HK和RR蛋白更加保守，幾乎沒有特異性結(jié)構(gòu)域。通過搜索比對和分析發(fā)現(xiàn)，ATCC39727基因組中含有豐富的TCS基因，共有213個相關(guān)編碼基因。進(jìn)一步分析其中112個基因編碼HK蛋白，包含60個TCS HK-RR和52個孤兒HK，99個基因編碼TCS RR蛋白，包含60個HK-RR和39個孤兒RR，另外還有2個融合HK(表2)。盡管在細(xì)菌基因組中TCS基因所占比例不大(通常低于5%)，但在調(diào)控微生物生理生化代謝中發(fā)揮重要作用。

表1 幾種模式微生物TCS系統(tǒng)比較Tab.1 Comparison of TCSs from different model microorganisms

2.2 ATCC39727基因組HKs蛋白分類

從ATCC39727基因組中搜索到所有可能的HK蛋白后，用Pfam、SMART和NCBI進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。TCS的HK蛋白通常為跨膜蛋白，包含胞外信號感應(yīng)域(sensing domain)、胞內(nèi)信號傳遞域(transmitter domain)和ATP酶域(ATPase domain)[5]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的組成情況，ATCC39727中112個HK蛋白分為14組，其中65個HK蛋白含有多個重復(fù)序列和HATPase_c結(jié)構(gòu)域，35個HK蛋白含有HAMP、HisKA和HATPase_c3個結(jié)構(gòu)域，其余12個HK蛋白含有各異的結(jié)構(gòu)域組合，感應(yīng)結(jié)構(gòu)域主要有HAMP、GAF和PAS(圖1)。HATPase_c結(jié)構(gòu)域是胞內(nèi)負(fù)責(zé)將ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到組氨酸上的催化結(jié)構(gòu)域，HisKA則是接受磷酸的受體結(jié)構(gòu)域，HAMP結(jié)構(gòu)域是受體組氨酸激酶和甲基接受蛋白的細(xì)胞質(zhì)螺旋連接結(jié)構(gòu)域，PAS結(jié)構(gòu)域與感應(yīng)外界氧、氧化還原電位和光的變化有關(guān)，GAF結(jié)構(gòu)域主要對環(huán)核苷酸結(jié)合發(fā)揮作用，例如cGMP和cAMP等。

表2 Nonomuraea sp.ATCC39727基因組中雙組份系統(tǒng)Tab.2 Two-component signal transduction systems in Nonomuraea sp.ATCC39727

續(xù)表2

根據(jù)結(jié)構(gòu)域功能可將HK蛋白分為胞質(zhì)感應(yīng)HK、胞外感應(yīng)HK和膜感應(yīng)HK。含有PAS和GAF結(jié)構(gòu)域的HK為胞質(zhì)感應(yīng)HK，含有跨膜和HAMP結(jié)構(gòu)域的HK為胞外感應(yīng)HK，僅含有跨膜結(jié)構(gòu)域和HATPase_c的為膜感應(yīng)HK。從圖1可以看出，ATCC39727中的HK蛋白絕大多數(shù)是胞外感應(yīng)和膜感應(yīng)類型。

為了解ATCC39727基因組中TCS基因的相互關(guān)系，分別對ATCC39727菌株中所有的HK和RR蛋白序列進(jìn)行比對和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)行使不同功能的HK蛋白之間的序列保守性弱，呈現(xiàn)多樣性，而RR蛋白的保守性則要強一些。另外從HK-RR來比較，同源相近的HKs對應(yīng)的RRs并不同源，反映了TCS進(jìn)化的多樣性(圖2)。

2.3 ATCC39727基因組RRs蛋白分類

與HK相比，RR在長度和組成上都相對保守，它由N端含有Asp殘基的高度保守的信號接受域(receiver domain)以及C端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(effector domain)兩部分組成。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的差異，ATCC39727中的RR蛋白可以分為6類(圖3)。其中含有REC和HTH_LUXR結(jié)構(gòu)域的RR蛋白最多，共有57個；其次有24個RR蛋白含有REC和Trans reg_c結(jié)構(gòu)域；RR蛋白中最多的結(jié)構(gòu)域是REC結(jié)構(gòu)域(趨化蛋白CheY同源的受體結(jié)構(gòu)域)，ANTAR結(jié)構(gòu)域是RNA結(jié)合輸出域，HTH_LUXR 結(jié)構(gòu)域起到結(jié)合DNA和轉(zhuǎn)錄激活的作用。

圖1 TCS HKs蛋白結(jié)構(gòu)域類型Fig.1 Conserved domain compositionof TCS HK proteins

2.4 ATCC39727 TCS功能預(yù)測

根據(jù)ATCC39727基因組中HKs和RRs蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和相對位置，發(fā)現(xiàn)了60對不同的TCS。根據(jù)Blast P結(jié)果注釋和相關(guān)文獻(xiàn)，對60對TCS的功能進(jìn)行了預(yù)測和分析(表3)。結(jié)果表明，ATCC39727中的TCS同其他微生物中的功能類似，主要包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的合成和調(diào)節(jié)，例如VraS/VraR(調(diào)節(jié)肽聚糖合成)、LiaS/LiaR(與細(xì)胞壁壓力和抗菌肽調(diào)節(jié)相關(guān))、MtrA/MtrB(調(diào)節(jié)滲透壓)、DesR/DesK(調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動性)；調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)分化，例如BaeS/BaeR(調(diào)節(jié)DNA起始復(fù)制)、ArlS/ArlR(調(diào)控接合和自溶)、DevR/DevS(啟動細(xì)胞休眠)、DegS/DegU(調(diào)控生物膜形成)、PrrB/PrrA(調(diào)控細(xì)胞早期增殖)、YdfH/YdfI(參與細(xì)胞分化)；參與營養(yǎng)元素代謝，例如NarS/NarL(參與硝酸鹽代謝)、PhoP/PhoR(參與磷代謝)、NreB/NreC(參與硝酸鹽異化和亞硝酸鹽代謝)、NarX/NarP(調(diào)節(jié)氮代謝)；調(diào)節(jié)重金屬離子平衡和抗性，例如CzcS/CzcR(調(diào)節(jié)Zn代謝)、CopS/CopR(與銅抗性基因有關(guān))、CutS/CutR(調(diào)節(jié)銅代謝)、IrlR/IrlS(與重金屬抗性有關(guān))、PcoS/PcoR(活化銅抗性基因)、TcrY/TcrX(與鐵缺乏有關(guān))；與細(xì)胞抗性和毒力相關(guān)，例如YvfT/YvfU(與細(xì)菌毒力有關(guān))；調(diào)節(jié)細(xì)胞呼吸和途徑代謝，例如ResD/ResE(調(diào)控有氧和無氧呼吸)、MprB/MprA(全局調(diào)控子)、UhpC/UhpB(調(diào)控己糖磷酸化)。

2.5 ATCC39727中TCS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過對ATCC39727基因組中的TCS進(jìn)行功能預(yù)測，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，構(gòu)建了ATCC39727中部分TCS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。TCS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的顯著特征是相互交叉，呈現(xiàn)“一對多或多對一”的級聯(lián)反應(yīng)(圖4)。例如在缺氧情況下，ResD誘導(dǎo)YclJK雙組份表達(dá)，進(jìn)一步Y(jié)clJK正調(diào)控YsfCD表達(dá)，后者又同時被DesSU負(fù)調(diào)控。又例如在磷酸鹽缺乏時，PhoR/PhoP系統(tǒng)激活，誘導(dǎo)另一組磷代謝相關(guān)的雙組份系統(tǒng)PhoA/PhoB，同時會抑制氮代謝相關(guān)蛋白GlnA的表達(dá)，而GlnA會通過TnRA蛋白與DegS/DegU相互作用。在ATCC39727中存在多個與金屬離子代謝相關(guān)的TCS。CopS/CopR在環(huán)境中銅離子的壓力下激活，進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因copABCD表達(dá)，copABCD的表達(dá)會進(jìn)一步激活PcoS/PcoR，Pco相關(guān)蛋白的表達(dá)外排銅離子、抵抗銅離子的毒害。類似的，鋅離子的存在會激活CzcS/CzcR，進(jìn)而誘導(dǎo)czcC基因的表達(dá)。CopS/CopR和CzcS/CzcR兩個雙組份系統(tǒng)都會抑制oprD基因(細(xì)胞膜孔道蛋白)的表達(dá)。

3 討論

圖2 TCS HKs和RRs蛋白進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic trees of HK and RR proteins

圖3 TCS RRs蛋白結(jié)構(gòu)域類型Fig.3 Conserved domain composition of TCSRR proteins

糖肽抗生素是一類重要的抗生素，是臨床上治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等“頑劣菌株”的最后一道防線。目前糖肽抗生素已經(jīng)發(fā)展到第二代，都是直接來源于微生物的天然產(chǎn)物或衍生物。以A40926為前體的達(dá)巴萬星是第二代糖肽抗生素中活性最強的，其半衰期長達(dá)174h，臨床上一周僅給藥1次。野野村放線菌是A40926生產(chǎn)菌株，其全基因組已測序完成，基因組大小11.85Mb，基因組上分布有豐富多樣的TCS雙組份系統(tǒng)，共有213個相關(guān)HK和RR編碼基因。ATCC39727中的只有極少數(shù)TCS系統(tǒng)得到實驗驗證，其中途徑特異性調(diào)控基因dbv22(HK)和dbv6(RR)是一對TCS系統(tǒng)，但Grasso等[33]證實dbv6并不影響A40926的表達(dá)。盡管TCS系統(tǒng)中典型的HK蛋白含有4個保守結(jié)構(gòu)域，但ATCC39727的HK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域有14種組合類型，其中最保守的結(jié)構(gòu)域是HATPase，每一種組合類型都有該結(jié)構(gòu)域，這種組合多樣的特征可能是由于其為了更好的適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境變化而發(fā)生的進(jìn)化。本文通過生物信息學(xué)分析初步構(gòu)建了部分TCS系統(tǒng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在此基礎(chǔ)上，本文將在下一步工作中重點研究ATCC39727中雙組份對A40926次級代謝途徑的影響。

圖4 ATCC39727中TCS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.4 TCS regulation network in ATCC39727