楊 婧,袁 朗,韓凱凱,劉青濤,劉宇卓,趙冬敏,黃欣梅,章麗嬌,姜 波,姜亮亮,宇善廣,崔國玉,李 銀*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部 獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014;2.山東省煙臺(tái)市牟平區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站,山東 煙臺(tái) 264100;3.山東省煙臺(tái)市牟平區(qū)大窯獸醫(yī)站,山東 煙臺(tái) 264100)

禽流感(AI)是由A型禽流感病毒引發(fā)的高度接觸性傳染病[1]。根據(jù)禽流感的表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性的不同而分型,HA有18種亞型,NA有11種亞型[2]。根據(jù)致病性不同又可分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感[3]。H9N2亞型禽流感病毒為低致病性禽流感病毒,呈世界性分布,并可以傳播到人類和低等哺乳類動(dòng)物。自1998年以來,已有多起人感染H9N2 AIV的報(bào)道[4]。此外, H9N2 AIV存在重組現(xiàn)象,可為形成跨種傳播的新型流感病毒提供條件[5]。

研究表明,養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)環(huán)境與雞群感染疾病息息相關(guān),活禽市場亦是重要的禽流感病毒感染地[6],也是與消費(fèi)者日常生活密切相關(guān)的場所。因此對養(yǎng)殖場和活禽市場中的禽流感進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查具有重要的公共衛(wèi)生意義。本研究于2017年對江蘇省南京市、常州市、無錫市、徐州市、連云港市、鹽城市等地區(qū)的活禽市場、養(yǎng)殖場進(jìn)行了禽流感流行病學(xué)調(diào)查與分析,以期為深入了解該地區(qū)禽流感感染狀況和防控措施的制定提供技術(shù)支持。

HA基因是A型流感病毒致病性的主要影響因子[7],能識別兩種類型的受體,分別為α-2,3-(禽流感受體)和α-2,6-半乳糖(人流感受體)連接的唾液酸。PB2蛋白含有1個(gè)色氨酸富集區(qū)[8],識別并結(jié)合宿主前mRNA 5′端的帽子結(jié)構(gòu)[9]；利用PB1蛋白的核酸酶活性對宿主mRNA進(jìn)行裂解[10],以此作為病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄引物。

禽流感病毒的基因易發(fā)生重組和漂移,為了了解2017年我國江蘇地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的變異情況，探討其HA、PB2基因是否發(fā)生了重組,特選取2017年所分離的4個(gè)H9N2亞型禽流感病毒分離株,對其HA、PB2基因進(jìn)行了測序,分析了它們的遺傳演化規(guī)律,研究了H9N2禽流感病毒的變異情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

自2017年1月至2017年12月,在江蘇省南京市、常州市、無錫市、徐州市、連云港市、鹽城市等地區(qū)的活禽市場和養(yǎng)殖場采集雞、鴨、鵝拭子。

0.45 μm微孔濾膜過濾器, Millipore Ireland Ltd.產(chǎn)品;生理鹽水,自配, pH 6.8～7.0;1%雞紅細(xì)胞溶液,實(shí)驗(yàn)室自制,現(xiàn)用現(xiàn)配;9～11日齡SPF雞胚,購自南京天邦生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、RNase Out、10 mmol/L dNTP、5×Buffer、10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2、聚合酶(ExTaq)等,均購自TaKaRa公司;瓊脂糖(BIOWEST AGAROSE G-10),購自Gene Company LTD; Axygen RNA/DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒,均購自康寧生命科學(xué)有限公司; PCR儀,購自TaKaRa公司;電泳儀,購自南京普陽科學(xué)儀器研究所;全自動(dòng)凝膠成像分析儀(JS-680B),購自培清有限公司;高壓鍋(SY-450),購自徐州圣業(yè)醫(yī)療器械有限責(zé)任公司；青霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、制霉菌素、棉簽,均購自南京醫(yī)藥百信藥房有限責(zé)任公司。

其他材料和儀器:固體石蠟、打孔器、注射器、剪刀、鑷子、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、-70 ℃冰箱、-20 ℃冰箱等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 采集流調(diào)拭子樣品 采集樣品時(shí),將棉簽拭子插入泄殖腔和口咽部,輕輕旋轉(zhuǎn)拭子2～3圈,使其充分接觸采樣部位?？谘适米虞^容易采集,同時(shí)具有較高效價(jià)。采集糞便樣品時(shí)應(yīng)選擇新鮮、較濕潤的糞便。將采集后的棉簽拭子保存在含有四抗的滅菌后pH在7.2～7.5的生理鹽水中，其中四抗的濃度分別為青霉素2000 IU/mL、鏈霉素2 mg/mL、丁胺卡那霉素1000 IU/mL、制霉菌素1000 IU/mL。

1.2.2 處理拭子樣品 將采集后的拭子樣品置于-20 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次。以8000×g離心5 min,取上清,保存在-20 ℃冰箱備用。

取用0.45 μm濾器過濾后的拭子樣品上清0.2 mL，每胚尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚2枚,棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚,收取24～120 h內(nèi)死亡的和120 h之后未死亡雞胚的尿囊液,進(jìn)行血凝試驗(yàn)。

1.2.3 血凝試驗(yàn)(HA試驗(yàn)) 在96孔微量反應(yīng)板上自左向右每孔各加25 μL PBS緩沖液;在左側(cè)第一孔中加入25 μL病毒尿囊液,混合均勻,吸取25 μL至第二孔,如此依次倍比稀釋至第11孔時(shí),棄掉25 μL,第12孔為紅細(xì)胞PBS陰性對照;從右向左依次向每孔加入25 μL 1%雞紅細(xì)胞懸液,然后將96孔微量反應(yīng)板在振蕩器上微振幾下,在37 ℃溫箱中靜置20 min后開始觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 病毒RNA的提取 將血凝陽性樣品尿囊液在無菌條件下取出200 μL，置于經(jīng)高壓滅菌的1.5 mL離心管中,加入200 μL的V-L試劑后,在渦旋振蕩儀上混勻,靜置5 min;加入75 μL V-N試劑,在渦旋振蕩儀上混勻,以12000×g離心5 min;取上清，加入新的2 mL離心管中,再加入300 μL異丙醇(含無水乙醇),上下倒置混勻,轉(zhuǎn)移至新的含有吸附柱的2 mL離心管中,以3000×g離心1 min;棄濾液,加入500 μL Buffer W1(含無水乙醇),以12000×g離心1 min;棄濾液,加入800 μL Buffer W2(含無水乙醇),以12000×g離心1 min;棄濾液,以12000×g離心1 min;將吸附柱置于新的1.5 mL離心管中,加入15 μL的TE試劑后,靜置1 min,以12000×g離心1 min。此即為提取的總RNA。

1.2.5 病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄RT和H5-H7-H9禽流感病毒三重PCR擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄體系為:RNA 12.0 μL、10 mmol/L dNTP 2.0 μL、5×Buffer 4.0 μL、Unit 12 1.0 μL、M-MLV 1.0 μL、RNase Out 0.5 μL。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?65 ℃ 5 min,42 ℃ 60 min,98 ℃ 5 min。

H5-H7-H9禽流感病毒三重PCR擴(kuò)增體系為: cDNA 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、ddH2O 13.75 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、ExTaq0.25 μL、H5上游引物P10.5 μL、H5下游引物P20.5 μL、H7上游引物P30.5 μL、H7下游引物P40.5 μL、H9上游引物P50.5 μL、H9下游引物P60.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s,56 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.2.6 電泳和核酸膠純化及測序 配制1%瓊脂糖凝膠,進(jìn)行電泳。調(diào)節(jié)電泳儀為穩(wěn)壓模式,在80 V下電泳30 min。將陽性條帶切下后,用Axygen膠回收試劑盒純化陽性條帶,并送去測序。

1.2.7 H9陽性樣品用SPF雞胚純化后測序 選擇4株血凝價(jià)較高、宿主來源和分離地點(diǎn)不同的H9陽性樣品,分別命名為: A/Chicken/Jiangsu/S01/2017(簡稱S01)、A/Duck/Jiangsu/S02/2017(簡稱S02)、A/Chicken/Jiangsu/S03/2017(簡稱S03)、A/Goose/Jiangsu/S04/2017(簡稱S04)。用有限稀釋克隆法接種9～11日齡SPF雞胚，獲取較單一的H9樣品,按照1.2.4～1.2.6中的方法進(jìn)行HA、PB2片段的測序。

1.2.8HA、PB2基因的序列拼接和遺傳演化分析 用DNAStar軟件中的Seqman拼接所得HA、PB2基因序列,用MEGA 5.0分別對其進(jìn)行遺傳演化分析。從GenBank中獲得的代表性H9N2禽流感病毒的HA、PB2基因序列作為分析比較的參考序列(見表1)。

表1 HA、PB2基因遺傳演化分析的參考序列

2 結(jié)果與分析

2.1 采集流調(diào)拭子樣品

自2017年1月至2017年12月,每個(gè)月份均在江蘇省南京市、常州市、無錫市、徐州市、連云港市、鹽城市等地區(qū)的活禽市場、養(yǎng)殖場,采集雞、鴨、鵝拭子,共計(jì)2760份。

2.2 拭子樣品接胚后數(shù)據(jù)分析

各個(gè)月份的拭子樣品接胚后,收取尿囊液對其進(jìn)行血凝試驗(yàn)。除了2017年1月未檢測到血凝陽性樣品外,其余10個(gè)月份均有血凝陽性樣品。由表2可知：2017年5月的病毒陽性率最高,為36.73%;2017年9月次之,為26.92%;2017年4月居第三,為19.61%;2017年1月最低,為0%。2017年全年病毒陽性率差分的95%的置信區(qū)間為6.4124%～20.9058%。

表2 2017年1～12月流調(diào)樣品數(shù)據(jù)分析結(jié)果

2.3 H5-H7-H9禽流感病毒三重RT-PCR檢測血凝價(jià)陽性尿囊液數(shù)據(jù)分析

采用H5-H7-H9禽流感病毒三重RT-PCR方法對上述血凝價(jià)為陽性的雞胚尿囊液進(jìn)行鑒定,結(jié)果(表3)表明：2017年4月的H9禽流感病毒陽性率最高,為11.76%;2017年9月次之,為11.54%;2017年5月居第三位,為8.16%;2017年11月居第四位，為3.85%;其余月份均未分離到H9禽流感病毒。2017年1月至2017年12月間,H5禽流感病毒、H7禽流感病毒總的陽性率均為0%;H9禽流感病毒總的陽性率為3.26%,差分的95%置信區(qū)間為0.0780%～6.4980%。

表3 H5-H7-H9禽流感病毒三重RT-PCR檢測結(jié)果

圖1 4個(gè)H9N2病毒分離株HA基因的進(jìn)化樹

2.4 HA基因的遺傳分析

用MEGA 5.0對參考序列和本試驗(yàn)所得的4個(gè)H9N2病毒分離株的HA基因進(jìn)行遺傳演化分析,得到的進(jìn)化樹如圖1所示。

由進(jìn)化樹分析結(jié)果可知：這4個(gè)分離株的HA基因均屬于Y280-like分支, S01、S02、S03、S04與Y280核苷酸的同源性分別為91.7%、93.0%、87.2%、89.7%，與Y280氨基酸的同源性分別為93.6%、95.1%、89.0%、91.7%。這4個(gè)分離株之間HA基因核苷酸的同源性是87.2%～92.8%,氨基酸的同源性是88.5%～94.3%,其中S03與S04之間的親緣關(guān)系最近,兩者核苷酸的同源性是92.8%,氨基酸的同源性是94.3%。

分析此4個(gè)分離株的氨基酸序列發(fā)現(xiàn): HA裂解位點(diǎn)附近的氨基酸均為-R(K)SSR/GL-,無多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸插入,具有典型的低致病性禽流感病毒HA基因的特征。分析HA蛋白的受體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn):226位氨基酸均為亮氨酸(L)。

2.5 PB2基因的遺傳分析

用MEGA 5.0對參考序列和本試驗(yàn)所得的4個(gè)H9N2病毒分離株的PB2基因進(jìn)行遺傳演化分析,得到的進(jìn)化樹見圖2。

從進(jìn)化樹分析結(jié)果可知：這4個(gè)分離株的PB2基因均屬于G9-like分支, S01、S02、S03、S04與G9核苷酸的同源性分別為90.5%、90.3%、88.1%、89.6%，與G9氨基酸的同源性分別為92.8%、92.6%、89.3%、90.7%。這4個(gè)分離株之間PB2基因核苷酸的同源性是97.0%～99.5%,氨基酸的同源性是98.3%～99.7%,其中S01與S02之間的親緣關(guān)系最近,兩者核苷酸的同源性是99.5%,氨基酸的同源性是99.7%。

分析這4株分離株的氨基酸序列發(fā)現(xiàn):PB2基因第627位氨基酸均為谷氨酸(E),第701位氨基酸均為天冬氨酸(D),第448位氨基酸均為天冬酰胺(N),均未發(fā)生E627K的突變。

圖2 4個(gè)H9N2病毒分離株P(guān)B2基因的進(jìn)化樹

3 討論

本研究采集流調(diào)拭子樣品的結(jié)果表明，2017年江蘇省各地區(qū)禽流感病毒的分離率有兩個(gè)高峰期,分別是4～6月、9～11月,這可能與氣溫環(huán)境相關(guān),過熱過冷均不適宜該病毒的繁殖。而H9亞型禽流感病毒也是在4月分離率最高,在9月次之,這與氣溫環(huán)境的相關(guān)性非常明顯,也與病毒分離的研究結(jié)果一致。2017年未在江蘇省的活禽市場和養(yǎng)殖場中檢測出H5、H7亞型禽流感病毒,表明該省H5、H7亞型禽流感病毒的感染率較低。 對流感病毒HA蛋白的研究結(jié)果表明:第183、190和226位氨基酸是關(guān)鍵的受體結(jié)合位點(diǎn),與病毒的受體結(jié)合特性和宿主特性相關(guān),尤其是226位,當(dāng)為谷氨酸(Q)時(shí),其與α-2,3-半乳糖連接的唾液酸(禽流感受體)結(jié)合,當(dāng)為亮氨酸(L)時(shí),其與α-2,6-半乳糖連接的唾液酸(人流感受體)結(jié)合[11]。在本研究中,4株H9N2禽流感病毒的226位氨基酸均為亮氨酸(L),呈現(xiàn)出典型的人流感受體結(jié)合特性。Hatta等[12]研究發(fā)現(xiàn)， PB2蛋白第627位氨基酸從谷氨酸(E)到賴氨酸(K)的變異對禽流感病毒跨越種間屏障感染哺乳動(dòng)物起決定性作用。本研究發(fā)現(xiàn)4株分離株P(guān)B2蛋白第627位氨基酸均為谷氨酸(E),沒有發(fā)生E627K的突變,表明其對哺乳動(dòng)物不呈高致病力。Sun等[13]對2003～2008年中國北方不同地區(qū)的22株禽源和豬源H9N2毒株進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)同一時(shí)期不同地區(qū)病毒株之間同源性較高,但較早期病毒均有不同程度的變異和進(jìn)化。本研究的進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,當(dāng)分離毒株的年代越為接近時(shí),其同源性越高,與病毒分離地的相關(guān)性不大。由此表明, H9N2發(fā)生變異與時(shí)間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性[14]。綜上所述,本研究中的4株H9N2禽流感病毒具有結(jié)合人體的由α-2,6-半乳糖連接的唾液酸的能力,但尚未具有突破種間屏障感染哺乳動(dòng)物的能力,對公共衛(wèi)生安全存在一定的潛在威脅。

基于以上結(jié)果和分析,建議繼續(xù)加強(qiáng)對江蘇省各地區(qū)活禽市場、養(yǎng)殖場的禽流感流行病學(xué)調(diào)查。應(yīng)盡早取締活禽市場,加強(qiáng)養(yǎng)殖場綜合衛(wèi)生防疫管理,以確保公共衛(wèi)生安全。本研究中禽流感的高發(fā)季為春秋時(shí)節(jié),由此提示公眾在春秋時(shí)節(jié)需要做好禽流感的防御工作,盡量不接觸患病禽類。