肖 嵐李 誠程小平杜 昕

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2. 四川旅游學(xué)院食品學(xué)院，四川 成都 610100； 3. 四川高金實業(yè)集團有限公司，四川 遂寧 629000)

牦牛是中國青藏高原的特殊家畜，經(jīng)過世代的自然選擇，牦牛顯示出對低氧環(huán)境極好的適應(yīng)性，這可能與牦牛血液的特殊性有一定關(guān)系[1-3]。本課題組[4]前期采用枯草芽孢桿菌(SICC1.197)聯(lián)合堿性蛋白酶制備出牦牛血低聚肽，利用超濾離心得到分子量<1 kDa的牦牛血低聚肽，并對其體外(還原力、ABTS+·清除力、·OH清除能力、DPPH·清除能力、總抗氧化力以及脂質(zhì)過氧化抑制能力)和小鼠體內(nèi)(丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、總抗氧化能力)的抗氧化能力進行了檢測，發(fā)現(xiàn)牦牛血低聚肽具有良好的抗氧化能力。姚星辰等[5]報道牦牛活性蛋白具有顯著的延長小鼠抗缺氧時間的作用。牦牛血是否與抗缺氧功能有一定的關(guān)聯(lián)尚未見相關(guān)報道。為了解具有抗氧化活性的牦牛血低聚肽是否具有抗缺氧活性，課題組采用高、中、低劑量牦牛血低聚肽對小鼠進行了預(yù)試驗，常壓耐缺氧試驗結(jié)果顯示牦牛血低聚肽對小鼠缺氧耐受力有提高作用并呈劑量依賴性；亞硝酸鈉中毒存活試驗顯示，牦牛血低聚肽能延長缺氧小鼠的生存時間。因此，為了進一步證實牦牛血低聚肽的抗缺氧活性并了解其作用機制，本試驗擬體外培養(yǎng)H9c2心肌細胞建立缺氧損傷模型，探討牦牛血低聚肽對心肌細胞缺氧損傷的抑制作用及機制，旨在為進一步研究牦牛血低聚肽對抗缺氧作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛血低聚肽：氨基酸含量85.25 g/100 g，平均分子量<1 kDa，實驗室自制；

DMEM培養(yǎng)基、血清：美國Thermo Fisher Scientific公司；

CCK8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Caspase 3/9活性檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術(shù)公司；

細胞凋亡檢測試劑盒：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；

蛋白marker：北京全式金生物技術(shù)有限公司；

乳酸脫氫酶(LDH)測試試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC，ABTS法)測試試劑盒：南京建成生物工程研究所；

大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒：武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

三氣培養(yǎng)箱：HF-100型，上海力申科學(xué)儀器有限公司；

倒置顯微鏡：IX51型，奧林巴斯(中國)有限公司；

CO2恒溫培養(yǎng)箱：MCO-15AC型，三洋電機(中國)有限公司；

全自動酶標儀：Multiskan MK3型，美國Thermo Scientific公司；

流式細胞儀：CytoFLEX型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

實時熒光定量PCR儀：QuantStudio 6型，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司。

1.3 細胞株與分組

H9c2心肌細胞株：生工生物工程(上海)股份有限公司。

H9c2細胞(DMEM+10% FBS+1%雙抗)復(fù)蘇與培養(yǎng)融合至80%～90%后，進行細胞毒性試驗以及濃度預(yù)試驗，在此基礎(chǔ)上確定牦牛血低聚肽的用量。將H9c2細胞分組：正常對照組、缺氧組、牦牛血低聚肽低劑量組(0.05 mg/mL)、牦牛血低聚肽中劑量組(0.4 mg/mL)、牦牛血低聚肽高劑量組(3.2 mg/mL)。

1.4 試驗方法

1.4.1 細胞缺氧模型的建立 取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后，用培養(yǎng)基(含10% FBS+1%雙抗)調(diào)整細胞密度到5×104個/mL，接入96孔板，每組6個復(fù)孔，每孔100 μL細胞懸液，并設(shè)置空白孔，在細胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL無菌PBS，37 ℃ 5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜，待細胞融合至70%～80%后進行分組處理并藥物干預(yù)。正常對照組常氧條件培養(yǎng)，加藥組加藥預(yù)處理4 h后換為缺氧培養(yǎng)基含(2% FBS)并置于三氣培養(yǎng)箱缺氧培養(yǎng)48 h。

1.4.2 指標測定

(1) CCK-8法測定細胞存活率：按照1.4.1處理細胞，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養(yǎng)4 h，振蕩10 min，酶標儀測定各孔吸光值OD450。

(2) 流式細胞儀檢測細胞凋亡：按照1.4.1處理細胞，按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行，流式細胞儀上機檢測。

(3) 細胞培養(yǎng)上清液中T-AOC含量、TNF-α含量、乳酸脫氫酶(LDH)活性的測定：按照1.4.1處理細胞，按照測試試劑盒說明書的要求檢測T-AOC含量、TNF-α含量、LDH活性。

(4) Western Blot檢測細胞中p-Akt、Akt、Survivin蛋白表達：按分組要求處理細胞后，提取單層貼壁細胞總蛋白并對蛋白進行定量，蛋白變性，電泳分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(PVDF)膜上，采用ECL顯色系統(tǒng)進行免疫印跡顯色，沖洗膠片，晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

(5) 細胞中Caspase-3與Caspase-9活性：按照1.4.1處理細胞，按照試劑盒說明書的要求進行檢測。

(6) Western Blot法測定線粒體和細胞胞質(zhì)中細胞色素C的含量：按照1.4.1處理細胞，參考1.4.2(4)采用Western Blot法測定。

(7) QPCR檢測細胞中P13K、AKt、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α基因表達：按照1.4.1處理細胞，實時熒光定量PCR檢測mRNA。

(8) 細胞線粒體膜電位的檢測：按照1.4.1處理細胞后，按照線粒體膜電位檢測試劑盒操作說明進行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示有顯著性差異。統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞存活率和LDH釋放量的影響

如圖1(a)所示，與正常組相比，持續(xù)缺氧48 h導(dǎo)致H9c2細胞存活率均出現(xiàn)了一定程度的下降，差異極顯著(P<0.01)，表明H9c2細胞缺氧損傷明顯。采用高、中、低劑量的牦牛血低聚肽干預(yù)缺氧細胞，能提高缺氧細胞的存活率；與缺氧組比較，高、中劑量組對細胞凋亡的抑制作用極顯著(P<0.01)。此結(jié)果提示，牦牛血低聚肽具有改善缺氧H9c2細胞存活率的作用，且存在劑量依賴性。

正常情況下，LDH主要分布在心肌細胞胞質(zhì)中，是不能透過細胞膜進入膜外空間(如細胞培養(yǎng)液上清液)[6]，只有當細胞損傷后，LDH才會釋放進入細胞上清液中使其活性升高，因此，通過測定細胞上清液中LDH的活性可間接反映細胞的損傷程度。由圖1(b)可知，缺氧導(dǎo)致H9c2細胞培養(yǎng)液上清液中LDH的活性極顯著升高(P<0.01)，而牦牛血低聚肽預(yù)處理則可降低培養(yǎng)液上清液中LDH含量且存在劑量依賴性，其中高、中劑量組可極顯著降低LDH活性(P<0.01)。此結(jié)果提示，牦牛血低聚肽對缺氧心肌細胞的細胞膜顯示出良好的保護作用，且存在劑量依賴性。

與正常對照組相比，# P<0.05，## P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01

2.2 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞凋亡的影響

圖2(a)顯示，正常對照組H9c2細胞凋亡不明顯(凋亡率<5%)；圖2(b)顯示，缺氧組H9c2細胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，凋亡率<10%，表明缺氧可促進心肌細胞凋亡；圖2(c)～(e)顯示牦牛血低聚肽3個劑量組均能減少缺氧介導(dǎo)的H9c2細胞凋亡，且中、高劑量組具有極顯著效果(P<0.01)。這與2.1的試驗結(jié)果相對應(yīng)，再次提示牦牛血低聚肽對缺氧導(dǎo)致的心肌細胞損傷具有較好的保護作用。

2.3 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞線粒體膜電位的影響

線粒體是細胞呼吸的主要場所，缺氧會誘導(dǎo)線粒體結(jié)構(gòu)和動力學(xué)上的改變，包括線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，MMP)的坍塌、線粒體膜孔道的開放，從而影響膜內(nèi)信號物質(zhì)(如細胞色素C)的釋放等[7]，引起線粒體代謝紊亂，導(dǎo)致線粒體功能損傷，進而誘導(dǎo)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致線粒體膜瓦解，釋放Caspase蛋白[8]，激活下游的凋亡通路[9]，誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。因此，線粒體膜電位在凋亡起始過程對防治缺氧相關(guān)疾病的發(fā)生非常重要。

本試驗觀察到持續(xù)缺氧處理H9c2細胞48 h，其MMP出現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)，而牦牛血低聚肽干預(yù)組則可抑制缺氧導(dǎo)致的MMP下降，中劑量組有顯著效果(P<0.05)，而高劑量組的效果極顯著(P<0.01)(圖3)。結(jié)果提示，牦牛血低聚肽可能通過維持缺氧條件下細胞MMP的穩(wěn)定進而減少細胞損傷。

2.4 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞線粒體內(nèi)細胞色素C釋放的影響

線粒體損傷是誘發(fā)細胞調(diào)亡的主要原因之一[11]。2.3 的研究結(jié)果提示牦牛血低聚肽可顯著地提高細胞在缺氧條件下的線粒體膜電位，保護線粒體結(jié)構(gòu)的完整。故本試驗采用Western Blot法測定線粒體和細胞胞質(zhì)中細胞色素C的含量，線粒體細胞色素C含量與細胞胞質(zhì)中細胞色素C的含量的比值常被用作反映線粒體結(jié)構(gòu)損傷程度的指標[12]，結(jié)果見圖4。缺氧誘導(dǎo)細胞色素C從線粒體中大量的釋放，而細胞胞質(zhì)中細胞色素C含量顯著增加，表現(xiàn)為線粒體中細胞色素C含量與細胞胞質(zhì)中細胞色素C的含量的比值極顯著下降(P<0.01)，僅為正常對照組的50%；然而，牦牛血低聚肽預(yù)處理則可抑制缺氧H9c2細胞線粒體中細胞色素C的釋放(P<0.01)且呈劑量依賴性，進一步提示牦牛血低聚肽對缺氧心肌細胞的保護作用與維持細胞線粒體結(jié)構(gòu)完整性、減少其細胞色素C釋放有關(guān)。

與正常對照組相比，# P<0.05，## P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01

2.5 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞中p-Akt、Akt、Survivin蛋白表達的影響

PI3K-Akt信號通路是一條重要的抗凋亡/促增殖信號途徑[13]，文獻[14]證實激活PI3K-Akt信號通路在抗凋亡過程中起關(guān)鍵作用。激活PI3K-Akt通路促進Akt在Ser473位點磷酸化后形成P-Akt，有利于對多下游多個靶點的調(diào)控，比如調(diào)控凋亡蛋白Caspase家族促進抗凋亡機制的活化，增加細胞存活[15]。如圖5所示，與正常對照組比較，持續(xù)缺氧導(dǎo)致H9c2細胞中p-Akt蛋白顯著過表達(P<0.01)；牦牛血低聚肽進一步促進了缺氧細胞中的p-Akt蛋白過表達且呈劑量依賴性，其中高、中劑量組過表達最明顯(P<0.01)。持續(xù)缺氧也導(dǎo)致細胞中Akt蛋白過表達，但牦牛血低聚肽對缺氧細胞中AKt蛋白表達水平無顯著影響(P>0.05)。計算p-Akt/Akt的比值，與正常組相比，缺氧組p-Akt/Akt的比值為正常對照組的5.55%，明顯降低(P<0.01)；與缺氧組相比，牦牛血低聚肽各劑量均能增加p-Akt/Akt的水平，分別為正常對照組的7.6%，35.7%，38.6%，高、中劑量組增加最為明顯(P<0.01)。結(jié)果提示，牦牛血低聚肽對缺氧心肌細胞的保護作用可能與PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

存活素蛋白(Survivin)具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞周期的雙重功能[16-17]。與正常對照組比較，缺氧誘導(dǎo)Survivin蛋白表達量顯著下降(P<0.01)；而牦牛血低聚肽干預(yù)缺氧H9c2細胞可劑量依耐性地促進Survivin蛋白表達水平提高，其中高、中劑量組增加最明顯(P<0.01)。

與正常對照組相比，# P<0.05，## P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01

圖3 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞線粒體膜電位的影響

Figure 3 Effect of yak blood oligopeptide on mitochondrial membrane potential of hypoxia H9c2 cells (n=6)

與正常對照組相比，## P<0.01；與缺氧組相比，** P<0.01

Figure 4 Effect of yak blood oligopeptide on cytochrome C release from mitochondria of hypoxia-induced H9c2 cells (n=6)

2.6 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞中Caspase-3與Caspase-9表達的影響

調(diào)控細胞凋亡的蛋白分布在線粒體外膜上[12]，主要包括抑制細胞凋亡的蛋白[18]和促進細胞凋亡的蛋白，具有維持或破壞線粒體膜完整性的作用[19]。正常情況下，這兩類蛋白的表達量處于相對平衡的狀態(tài)，當缺氧介導(dǎo)細胞時，促凋亡蛋白會過表達而破壞線粒體，進而促進細胞調(diào)亡發(fā)生[20]，而當抑制細胞凋亡蛋白表達量較高時，可抑制細胞調(diào)亡。如圖6所示，與正常對照組比較，持續(xù)缺氧導(dǎo)致H9c2細胞中凋亡蛋白Caspase-3[圖6(a)]以及Caspase-9[圖6(b)]極顯著過表達(P<0.01)；而牦牛血低聚肽干預(yù)則可劑量依賴性地下調(diào)這2個凋亡蛋白的表達，其中高、中劑量組減少最明顯(P<0.01)。此結(jié)果提示，抑制缺氧條件下凋亡蛋白Caspase-3/-9蛋白的表達有可能是牦牛血低聚肽發(fā)揮細胞缺氧損傷保護作用的機制之一。

與正常對照組相比，# P<0.05，## P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01

圖5 牦牛血低聚肽對缺氧條件下H9c2細胞中p-Akt、Akt、Survivin蛋白表達的影響

Figure 5 Effect of yak blood oligopeptide on expression of p-Akt, Akt and Survivin proteins in hypoxia-induced H9c2 cells (n=6)

與正常對照組相比，## P<0.01；與缺氧組相比，** P<0.01

Figure 6 Effect of yak blood oligopeptide on expression of Caspase-3 and Caspase-9 proteins in hypoxi-ainduced H9c2 cells (n=6)

2.7 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞中P13K、AKt、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α基因表達的影響

本試驗檢測了5個與缺氧細胞凋亡相關(guān)的基因，結(jié)果見表1。持續(xù)缺氧導(dǎo)致H9c2細胞中的Caspase-3/-9的mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)；而牦牛血低聚肽預(yù)處理組則可下調(diào)這2個凋亡基因的表達，其中高劑量組減少最明顯(P<0.01)；Caspase-3/-9的mRNA表達水平的變化趨勢與2.5測定的蛋白結(jié)果對應(yīng)。結(jié)果提示，牦牛血低聚肽可通過抑制凋亡蛋白及其mRNA的表達從而發(fā)揮保護心肌細胞H9c2的作用。

與正常對照組相比，缺氧導(dǎo)致H9c2細胞中P13K的mRNA表達水平升高(P<0.05)，而AKt的mRNA表達水平降低，但無顯著差異(P>0.05)；牦牛血低聚肽各劑量均能促進缺氧細胞P13K的mRNA表達水平的增加，其中高劑量組增加最明顯(P<0.01)，而對缺氧細胞中AKt的mRNA表達水平無顯著影響(P>0.05)；PI3K-Akt信號通路的mRNA表達水平的變化趨勢與2.5測定的蛋白結(jié)果對應(yīng)。

低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)是機體調(diào)控低氧反應(yīng)基因的核心轉(zhuǎn)錄因子[21]，HIF-1α的mRNA表達水平升高可啟動對多個下游低氧反應(yīng)基因的調(diào)控[22]，介導(dǎo)與缺氧有關(guān)的各種生理反應(yīng)[23]，有利于細胞適應(yīng)低氧環(huán)境[24]。由表1可知，心肌細胞持續(xù)缺氧48 h誘導(dǎo)H9c2細胞中HIF-1α的mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)，原因是缺氧抑制了PHD(脯氨酰羥化酶)活性導(dǎo)致HIF-1α的脯氨酰殘基羥化受到抑制，進而抑制HIF-1α與腫瘤抑制蛋白VHL結(jié)合，使HIF-1α的mRNA表達呈指數(shù)方式增長[25]。本研究結(jié)果顯示，牦牛血低聚肽干預(yù)缺氧細胞能劑量依耐性地增加HIF-1α的mRNA表達水平，其中高、中劑量組增加最明顯(P<0.01)。結(jié)果提示，牦牛血低聚肽可通過誘導(dǎo)HIF-1α的mRNA表達水平升高進而提高細胞低氧適應(yīng)性。

表1 牦牛血低聚肽對缺氧條件下H9c2細胞中P13K、AKt、Caspase-3、Caspase-9以及HIF-1α基因表達的影響?

? 與正常對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01。

2.8 牦牛血低聚肽對細胞培養(yǎng)上清液中T-AOC、TNF-α的影響

缺氧誘導(dǎo)心肌細胞能量代謝紊亂、氧自由基增多，進而促進細胞膜脂質(zhì)過氧化而導(dǎo)致細胞損傷，引起細胞凋亡[26]，因此，總抗氧化能力(T-AOC，ABTS法)的強弱直接影響心肌細胞的存活狀態(tài)，反映心肌細胞受損傷的程度。如表2所示，與對照組比較，缺氧組上清液的T-AOC極顯著降低(P<0.01)，而牦牛血低聚肽可提高心肌細胞上清液的T-AOC且顯現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性(P<0.01)，提示牦牛血低聚肽可減少細胞氧自由基、減少胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生[27]，從而保護心肌細胞。

由細胞外信號導(dǎo)致的細胞凋亡稱為死亡受體途徑[28]，又稱外源性凋亡途徑。TNFR-Ⅰ和TNFR-Ⅱ是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族中的2個受體亞型[29]，可介導(dǎo)細胞凋亡[30]。TNFR-Ⅰ經(jīng)過三聚體化后可激活Caspase途徑進而誘導(dǎo)細胞凋亡；TNFR-Ⅱ的激活可抑制NFκB的活性進而減少炎癥因子TNF-α的釋放，減少細胞凋亡[31]。本試驗結(jié)果顯示，缺氧組H9c2細胞上清液中TNF-α含量極顯著增高(P<0.01)；牦牛血低聚肽3個劑量組均能劑量依耐性地降低缺氧H9c2細胞上清液中TNF-α含量，其中高劑量組效果最明顯(P<0.01)。結(jié)果提示，牦牛血低聚肽可通過死亡受體途徑減少TNF-α含量而發(fā)揮對心肌細胞缺氧損傷的保護作用。>

表2牦牛血低聚肽對細胞培養(yǎng)上清液中T-AOC、TNF-α的影響?

Table2EffectofyakbloodoligopeptideonT-AOCandTNF-alphaincellculturesupernatant

分組TNF-α/(pg·mL-1)T-AOC/(U·mL-1)正常對照組58.242±11.003 0.720±0.031 缺氧組 235.002±17.050##0.150±0.011##低劑量組 191.024±11.855##??0.180±0.008##?中劑量組 121.189±10.290##??0.504±0.016##??高劑量組 82.958±8.967#??0.571±0.016##??

? 與正常對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與缺氧組相比，* P<0.05，** P<0.01。

3 結(jié)論

牦牛血低聚肽能夠劑量依賴性地提高缺氧(37 ℃，5% O2)條件下大鼠H9c2心肌細胞的存活率、降低其凋亡率以及LDH的釋放，表現(xiàn)出良好的缺氧細胞損傷防護功效。牦牛血低聚肽對缺氧H9c2大鼠心肌細胞的保護作用可能與其清除細胞氧自由基、抗細胞膜脂質(zhì)過氧化；抑制線粒體膜電位降低、抑制線粒體中細胞色素C的釋放、增加細胞中抗凋亡蛋白(Survivin)的表達、抑制凋亡蛋白(Caspase-3、Caspase-9)的表達、介導(dǎo)PI3K-Akt信號通路以及影響編碼上述蛋白的mRNA水平有關(guān)。在牦牛血低聚肽作用下抗缺氧相關(guān)蛋白之間的關(guān)聯(lián)和變化關(guān)系有待于在分子水平進一步研究。