王國(guó)財(cái)，袁 誠(chéng)，唐順之,關(guān)偉鍵，牟肖男，牛亞偉，傅玉萍，許文東

(廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司 中藥提取分離過(guò)程現(xiàn)代化國(guó)家工程研究中心，廣州 510006)

蛋黃卵磷脂是一種從雞蛋黃中精制而得的天然磷脂混合物，被廣泛應(yīng)用于脂肪乳、脂質(zhì)體等特殊注射劑中[1]。研究表明，蛋黃卵磷脂除了含有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)、磷脂酰肌醇(PI)外，還含有兩種微量的溶血磷脂，即溶血磷脂酰膽堿(LPC)和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)[2-5]。

蛋黃卵磷脂中的微量成分LPC和LPE具有較強(qiáng)的表面活性，在濃度較高時(shí)能夠使紅細(xì)胞膜破裂，引起溶血或細(xì)胞壞死。因此，中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液、丙泊酚注射液等脂肪乳制劑均將LPC、LPE作為影響其質(zhì)量的主要雜質(zhì)來(lái)控制[6-9]。目前，對(duì)于蛋黃卵磷脂中的LPC和LPE的含量測(cè)定有較多報(bào)道[2-5, 10]，但是對(duì)于其結(jié)構(gòu)鑒定鮮有報(bào)道。

本文通過(guò)柱層析法對(duì)蛋黃卵磷脂中的LPC和LPE進(jìn)行分離純化，利用核磁共振氫譜、碳譜，氣相色譜，ESI質(zhì)譜等鑒定手段，最終確定LPC和LPE的結(jié)構(gòu)，為蛋黃卵磷脂的質(zhì)量研究及溶血磷脂在臨床及用藥安全方面提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

蛋黃卵磷脂(廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司)，柱層析硅膠(青島海洋化工廠)，三氯甲烷、甲醇、三氟化硼、氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉等均為分析純，棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、PC、PE、PI、SM、LPE、LPC等標(biāo)準(zhǔn)品均從Sigma-Aldrich公司購(gòu)買。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Bruker AVANCE AV 500超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀，Agilent 6890N氣相色譜儀，5973N質(zhì)譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LPC和LPE的分離純化

取1 kg蛋黃卵磷脂，加適量三氯甲烷溶解后，進(jìn)行硅膠柱層析，用薄層板點(diǎn)板與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比收集餾分，先用氯仿-甲醇(體積比5∶1)洗脫液進(jìn)行洗脫，待第一個(gè)餾分(PE)洗脫完全后，收集第二個(gè)餾分，濃縮得LPE(8 g)。再用氯仿-甲醇(體積比3∶1)洗脫液進(jìn)行洗脫，待第三個(gè)和第四個(gè)餾分(PC和SM)洗脫完后，最后用甲醇進(jìn)行洗脫，收集第五個(gè)餾分，濃縮得LPC(30 g)。

1.2.2 ESI質(zhì)譜條件

依據(jù)JY/T 003—1996《有機(jī)質(zhì)譜分析方法通則》進(jìn)行ESI質(zhì)譜測(cè)定。電子能量70 eV，離子源溫度250℃，檢測(cè)器電壓1 200 V，儀器分辨本領(lǐng)為單位質(zhì)量分辨，掃描范圍(m/z)50～2 000。

1.2.3 核磁共振氫譜和碳譜條件

依據(jù)JY/T 007—1996《超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜方法通則》進(jìn)行核磁共振氫譜和碳譜測(cè)定。溶劑為氘代氯仿，氫譜內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷。

1.2.4 LPC和LPE脂肪酸組成檢測(cè)

1.2.4.1 甲酯化

取0.1 g樣品，置于50 mL錐形瓶中，加入0.5 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液2 mL，在65℃水浴中加熱回流30 min，放冷，加15%三氟化硼甲醇溶液2 mL，在65℃水浴中加熱回流30 min，放冷，加4 mL庚烷，繼續(xù)在65℃水浴中加熱回流5 min后，放冷，加飽和氯化鈉溶液10 mL，搖勻，靜置分層，取上層液，用水洗滌3次，每次2 mL，上層液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，用微孔濾膜過(guò)濾。備用。

1.2.4.2 氣相色譜條件

BPX-70毛細(xì)管脂肪酸分析柱(30.0 m×25 μm，0.25 μm)，柱溫190℃；進(jìn)樣口溫度210℃；氫火焰離子化檢測(cè)器溫度300℃，氮?dú)饬魉?.2 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 LPC結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 LPC質(zhì)譜及核磁數(shù)據(jù)

所分離得到的LPC性狀為白色粉末。

ESI-MSm/z:495.3，506.3，519.3，523.4；[M+H]+m/z：496.4，520.5，524.4；[M+Cl]-m/z：530.3，541.4，554.5，558.1。

1H-NMR(CDCl3,500 MHz):δ0.85～0.89(3H，m，H-a)，1.25(2H，m，H-b，H-g)，1.57(2H，m，H-h)，2.00～2.05(2H，m，H-c，H-f)，2.28～2.31(2H，m，H-i)，3.33(3H，s，H-p)，3.65(2H，m，H-o)，3.80+3.93(2H，m，H-m)，3.93(1H，m，H-l)，4.06～4.07(2H，m，H-k)，4.31(2H，m，H-n)，5.33～5.37(2H，m，H-d，H-e)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)：δ14.1(C-a)，24.9(C-h)，27.20(C-c，C-f)，22.7～31.9(C-b，C-g)，34.2(C-i)，54.2(C-p)，59.4(C-n)，65.2(C-k)，66.1(C-o)，67.1(C-m)，68.8(C-l)，127.9～130.2(C-d，C-e)，173.4(C-j)。

根據(jù)上述質(zhì)譜及核磁信息可鑒定該化合物為L(zhǎng)PC，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 溶血磷脂酰膽堿(LPC)化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.1.2 LPC總脂肪酸檢測(cè)

通過(guò)與脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比分析，LPC中主要脂肪酸組成為棕櫚酸(55.38%)、硬脂酸(25.34%)、油酸(14.26%)、亞油酸(3.95%)、棕櫚油酸(1.08%)。

2.1.3 LPC結(jié)構(gòu)確證

由于LPC化學(xué)結(jié)構(gòu)上只有1個(gè)脂肪酸殘基，并通過(guò)脂肪酸組成確定了LPC含有5種脂肪酸成分，基本確立了LPC的5種可能結(jié)構(gòu)構(gòu)型，在此基礎(chǔ)上通過(guò)ESI質(zhì)譜進(jìn)一步確證，其質(zhì)譜上顯示出m/z495.3、506.3、519.3、523.4主要的分子離子峰，表明LPC的化學(xué)結(jié)構(gòu)為1-棕櫚酰溶血磷脂酰膽堿、1-亞油酰溶血磷脂酰膽堿、1-硬脂酰溶血磷脂酰膽堿、1-油酰溶血磷脂酰膽堿4種結(jié)構(gòu)，其中以1-棕櫚酰溶血磷脂酰膽堿為主。

2.2 LPE結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 LPE質(zhì)譜及核磁數(shù)據(jù)

所分離得到的LPE性狀為白色粉末。

ESI-MSm/z:452.1，478.0，480.0；[M+H]+m/z：481.1。

1H-NMR(CDCl3,500 MHz):δ0.88(3H，m，H-a)，1.29(2H，m，H-b，H-g)，1.58(2H，m，H-h)，2.36(2H，m，H-i)，3.25(2H，m，H-o)，3.86+4.00(2H，m，H-m)，3.96(1H，m，H-l)，4.06～4.07(2H，m，H-k)，4.31(2H，m，H-n)，7.96(2H，m，H-p)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz):δ14.1(C-a)，22.7(C-b)，24.9(C-h)，27.20(C-c，C-f)，22.7～32.0(C-b，C-g)，34.0(C-i)，40.2(C-o)，62.2(C-n)，64.9(C-k)，67.1(C-m)，68.5(C-l)，173.4(C-j)。通過(guò)與LPC的氫譜碳譜進(jìn)行比較可知，LPE并沒(méi)有氮甲基信號(hào)(δH3.33與δC54.2)，而且存在氮質(zhì)子信號(hào)(δH7.96)。

結(jié)合質(zhì)譜信息及核磁數(shù)據(jù)可鑒定該化合物為L(zhǎng)PE，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2.2 LPE總脂肪酸檢測(cè)

通過(guò)與脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比分析，LPE中主要脂肪酸組成為棕櫚酸(22.41%)、硬脂酸(67.25%)、油酸(7.44%)。

2.2.3 LPE結(jié)構(gòu)確證

由于LPE化學(xué)結(jié)構(gòu)上只有1個(gè)脂肪酸殘基，并通過(guò)脂肪酸組成確定了LPE含有的3種脂肪酸成分，基本確立了LPE的3種可能化學(xué)結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上通過(guò)ESI質(zhì)譜進(jìn)一步進(jìn)行確證，其質(zhì)譜上具有m/z452.1、478.0、480.0分子離子峰，表明LPE的結(jié)構(gòu)為1-棕櫚酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-油酰溶血磷脂酰乙醇胺3種結(jié)構(gòu)，其中以1-硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺為主。

3 結(jié) 論

本文以柱層析分離法對(duì)蛋黃卵磷脂中兩種溶血磷脂(LPC和LPE)進(jìn)行分離純化，采用ESI質(zhì)譜、氣相色譜、核磁共振對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最終確定蛋黃卵磷脂中的LPC具有1-棕櫚酰溶血磷脂酰膽堿、1-亞油酰溶血磷脂酰膽堿、1-硬脂酰溶血磷脂酰膽堿和1-油酰溶血磷脂酰膽堿4種結(jié)構(gòu)，LPE具有1-棕櫚酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-油酰溶血磷脂酰乙醇胺3種結(jié)構(gòu)。