李云琴，陳中華，原曉龍，王 毅

(云南省林業(yè)科學院云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室, 國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，昆明 650201)

神經(jīng)酸(Nervonic acid，NA)具有促進大腦發(fā)育、改善記憶、調(diào)節(jié)血脂等功效，對心血管疾病及免疫性疾病的治療效果顯著[1-3]，是大腦中神經(jīng)細胞及神經(jīng)纖維的核心天然成分，神經(jīng)酸還可以作為香料原料加以利用[4]。雖然神經(jīng)酸用途廣泛，對人體健康有益，但難以通過人體自身合成，需要從外界攝取。神經(jīng)酸最早在鯊魚油中獲取[5]，但鯊魚資源稀少且成本高昂，加之國際社會禁止大量捕殺鯊魚，神經(jīng)酸的來源受到限制，造成資源緊缺，市場供不應求。通過化學方法[6]和生物化學[2]合成神經(jīng)酸，終因副產(chǎn)物多、工藝路線長、得率低而失敗。后來，研究發(fā)現(xiàn)一些植物中富含神經(jīng)酸，如蒜頭果(Malaniaoleifera)及盾葉木(Macarangaadenantha)種仁，雞爪槭(Acerpalmatum)果實及遏藍菜(Thlaspiarvense)種子[7]、元寶楓(Acertruncatum)種子[8]等。而我國特有的鐵青樹科(Olacaceae)蒜頭果屬單種屬植物蒜頭果，為目前發(fā)現(xiàn)的自然界中神經(jīng)酸含量最高的植物[9]。研究顯示，蒜頭果種仁含油率高達64.5%[10]，其果仁油脂中神經(jīng)酸含量高達60%以上。因此，從蒜頭果果仁中提取神經(jīng)酸將為可持續(xù)開發(fā)利用植物神經(jīng)酸開創(chuàng)一條新路[11]。

神經(jīng)酸為超長鏈單不飽和脂肪酸(VLCMFA)[12]。VLCMFA以油酸為底物，通過超長鏈脂肪酸鏈延長循環(huán)進行碳鏈的延長，每循環(huán)1次延長2個碳原子，相繼形成鱈油酸(20∶1Δ9c)、芥酸(22∶1Δ13c)、神經(jīng)酸(24∶1Δ15c)[3]。這個延長過程受3-酮酯酰-CoA合酶、3-酮酯酰-CoA還原酶、3-羥酯酰-CoA脫水酶和羥酯酰-CoA還原酶形成的酶復合體的組合催化和調(diào)控，其中3-酮酯酰-CoA 合酶(KCS)目前被認為是關鍵催化步驟[13-15]，在整個超長鏈脂肪酸延長酶復合體中起到了極其重要的作用，因此也作為限速酶被廣泛應用[16-18]。目前對KCS的研究主要在油菜(Brassicanapus)[18]、大豆(Glycinemax)[19-20]、油桐(Verniciafordii)[21]、滇牡丹(Paeoniadelavayi)[22]等傳統(tǒng)油料植物中，而對蒜頭果的KCS相關研究未見報道，特別是超長鏈KCS在蒜頭果中神經(jīng)酸生物合成的作用并不清楚。因此，本研究利用轉錄組測序技術獲得蒜頭果果實中超長鏈KCS基因序列，同時，利用RT-PCR克隆獲得該基因，并進行生物信息學分析及表達分析，為最終揭示蒜頭果神經(jīng)酸生物合成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所需蒜頭果樹生長于文山州廣南縣舊莫鄉(xiāng)巖臘村，采集花謝后1、2、3、4個月的蒜頭果果實為材料，并采集花謝2個月后蒜頭果樹葉作為對照。樣品采集后即刻放入液氮中保存。

總RNA小量提取試劑盒購自美國Qiagen公司，pESY-T3克隆試劑盒與感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司，LA-Taq酶、反轉錄酶M-MLV購自大連寶生物工程有限公司。電泳儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 轉錄組分析

將花謝后3個月的蒜頭果果實送到華大基因通過Illumina Hiseq2000平臺進行轉錄組測序，對序列進行組裝拼接后，通過對轉錄組Unigene進行本地Blast,尋找蒜頭果果實轉錄組中的KCS基因，同時，將轉錄組數(shù)據(jù)中的Unigene注釋到NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫，檢索注釋結果中的KCS基因，并對獲得的Unigene進行分析。

1.2.2 提取RNA

提取蒜頭果果實RNA，按照RNA提取試劑盒說明書進行提取。分別提取每個樣品的RNA后，用1%的瓊脂膠進行電泳檢測RNA完整性。并分別取1 μg RNA用于反轉錄得到cDNA。將各樣品cDNA保存在-20℃冰箱備用。

1.2.3 蒜頭果KCS基因克隆

通過對蒜頭果轉錄組數(shù)據(jù)分析，獲得表達量高、并擁有完整開放閱讀框的KCS基因序列。以獲得的KCS基因序列,設計含有起始密碼子的特異引物(MoKCSF:5′-ATGGCTCAACCAAAGCTTGT-3′)和含有終止密碼子的特異引物(MoKCSR:5′-TTAGATGGCCGAGACTTGCG-3′)。以蒜頭果果實cDNA 為模板，用HiFi高保真聚合酶進行PCR擴增，電泳檢測后將目的片段連接到pGMT載體上，并轉入DH5α感受態(tài)細胞中，通過菌落PCR篩選出陽性克隆，送上海生工測序公司進行測序，最終通過序列比對確定獲得KCS全長基因片段，并永久保存在-80℃冰箱。

1.2.4 蒜頭果KCS蛋白生物信息學分析

用NCBI在線軟件ORFFinder對KCS基因進行蛋白翻譯后，并用在線軟件ProtParam對KCS蛋白理化性質(zhì)進行分析，KCS保守結構域分析由在線蛋白功能結構域分析軟件完成，其氨基酸同源序列比對則用DNAMAN 軟件完成，最終確定KCS的保守結構域。并將蒜頭果KCS蛋白與美國國家生物技術信息中心(NCBI)已知其他植物的超長鏈KCS蛋白進行多重比對后，采用MEGA7中自帶的ClusterW進行蛋白序列多重比對后，采用Neighbor-joining算法(自檢舉1 000 次)，繪制并進行進化樹分析。

1.2.5 蒜頭果KCS基因不同組織表達分析

分別取蒜頭果不同組織的RNA 2 μg，按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明合成cDNA第一條鏈。以不同組織的cDNA為模板，用特異引物TMoKCSF(5′-ATCTTTGGTGTTCTTGATCG-3′)和TMoKCSR(5′-ATTGAATAAG CTACAATTGA-3′)進行熒光定量PCR分析，并以elongation factor 1-alpha基因作為內(nèi)參基因，具體反應體系如下：分別向PCR管中加入2×SYBR Green master mix(含ROX) 12.5 μL； 引物TMo-KCSF和TMoKCSR各0.5 μL，cDNA 1 μL,最終用 PCR water nucle-free補足25 μL。PCR反應條件為：預變性溫度95℃，時間10 min，然后，變性溫度95℃，時間15 s；退火和延伸溫度為 60℃，時間為30 s，共40個循環(huán)。反應結束后，收集信息進行Ct值分析。

2 結果與分析

2.1 轉錄組分析

通過Illumina Hiseq2000平臺測序對蒜頭果果實轉錄組測序，總計產(chǎn)出6 299 384 146 bp數(shù)據(jù)。組裝結果得到165 110個Unigene。對所獲得的Unigene進行本地Blast以及在NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫比對分析， 最終獲得13個可能的KCS基因片段(見表1)。

表1 轉錄組分析得到的KCS基因信息

由表1可知，根據(jù)已知其他植物KCS基因大小在1 kb以上,從轉錄組數(shù)據(jù)中最終得到大于1 kb的KCS基因片段有2個。通過蛋白序列分析以及表達量分析最后確定c55526_g1作為后續(xù)克隆分析的對象。

2.2 RNA提取與基因克隆

將蒜頭果不同時期的果實和葉片樣品，經(jīng)過液氮磨碎后，用RNA提取試劑盒提取各樣品RNA，并進行電泳檢測查看其完整性，電泳結果見圖1。

注：F1、F2、F3、F4分別為花謝1、2、3、4個月后蒜頭果果實; Leaf為花謝2個月后蒜頭果樹葉。

圖1 提取的RNA電泳結果

由圖1可看出，所有樣品均有完整的28S和18S兩個條帶，說明RNA完整性比較好。條帶明亮度不一樣說明提取的各個樣品RNA濃度不一樣。用分光光度計測量各樣品RNA在260、280 nm下的吸光度。檢測顯示各樣品OD260/OD280值均在1.8～2.1之間，適合于后續(xù)反轉錄實驗。

基于轉錄組數(shù)據(jù)中獲得的KCS基因片段序列的特異引物(MoKCSF和MoKCSR)，以MoKCSF和MoKCSR為引物，以蒜頭果花謝2個月后的果實cDNA為模板，進行高保真PCR擴增，將擴增出來的目的片段連接到克隆載體中，并進行測序比對驗證。最終獲得 1 539 bp的蒜頭果KCS基因全長cDNA，并命名為MoKCS1。

2.3 蒜頭果KCS蛋白序列分析

用NCBI在線軟件ORFFinder對KCS基因進行蛋白翻譯后，并用在線軟件ProtParam對KCS蛋白理化性質(zhì)進行分析，結果顯示KCS基因共編碼512個氨基酸，其相對分子質(zhì)量為57 730.49，等電點為9.39。利用NCBI在線結構域分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)以及DNAMAN軟件對與KCS親緣關系近的其他植物KCS蛋白序列進行比對，見圖2。由圖2可以看出，該蛋白與已報道的KCS含有KCS家族的3個功能保守結構域“FGNTSSSS”“GSGFKCNSAVW”和“GMGCSA”，表明該蛋白屬于KCS 家族蛋白。蒜頭果KCS與榴蓮(Duriozibethinus)KCS的蛋白序列同源性為80.66%，與芝麻(Sesamumindicum)KCS同源性為79.49%，與山黃麻(Tremaorientalis) KCS同源性為78.72%。

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

將推導出來的KCS蛋白序列在美國國家生物技術信息中心(NCBI)進行比對，用MEGA7中自帶的ClusterW進行蛋白序列多重比對后，采用Neighbor-joining算法(自檢舉1 000 次)，繪制出蒜頭果KCS與其他植物的KCS蛋白的進化樹，見圖3。從圖3可以看出，蒜頭果的KCS蛋白在系統(tǒng)進化樹上自成一支，與目前發(fā)現(xiàn)的KCS蛋白的親緣關系都相對較遠。

2.5 熒光定量PCR檢測KCS基因不同組織表達

為了解KCS基因在蒜頭果不同個體之間的表達差異，以特異引物TMoKCSF和TMoKCSR，用熒光定量PCR檢測KCS基因在不同樣品中的表達情況，結果見圖4。由圖4可以看出，KCS基因在不同個體中以花謝3個月后蒜頭果果實表達量最高，花謝2個月后蒜頭果果實次之，而在花謝1個月及4個月后的蒜頭果果實和蒜頭果葉中表達都非常微弱。

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注：MoKCS.蒜頭果KCS(登錄號：MK210592);DzKCS.榴蓮KCS(登錄號：XP_022729498.1)；SiKCS.芝麻KCS(登錄號：XP_011081914.1)；ToKCS.山黃麻KCS(登錄號：PON90748.1)。

圖2 KCS蛋白序列比對

圖3 蒜頭果KCS與其他植物KCS蛋白系統(tǒng)進化樹

注：MoF1、MoF2、MoF3、MoF4分別為花謝1、2、3、4個月后蒜頭果果實KCS基因;MoLe為花謝2個月后蒜頭果樹葉KCS基因。

圖4 蒜頭果KCS基因表達情況

3 討 論

神經(jīng)酸(C24∶1)具有獨特的工業(yè)用途和潛在的藥用保健功效，近年來得到了國內(nèi)外的廣泛關注。特別是從植物中獲取神經(jīng)酸受到許多研究者的青睞。雖然很多植物含有神經(jīng)酸，但是大多含量很低，蒜頭果是目前神經(jīng)酸含量最高的植物，因此可以在揭示蒜頭果中神經(jīng)酸生物合成機理的情況下，利用分子輔助育種等方式培育出高產(chǎn)神經(jīng)酸的蒜頭果新品種，或利用基因工程通過異源表達的方式利用酵母[23-24]大量獲得神經(jīng)酸。因此，本研究開展蒜頭果中神經(jīng)酸生物合成關鍵酶KCS基因的克隆及表達分析。

目前已有一些關于KCS基因通過異源表達提高神經(jīng)酸含量的研究，如Guo等[18]報道通過引入銀扇草的KCS基因來增加酵母和轉基因植物中神經(jīng)酸含量；Taylor等[25]報道了在碎米薺屬油籽中，一種KCS基因的分子克隆和特性，以及其在碎米薺屬油籽中的異源表達，為潛在的醫(yī)療和工業(yè)用途提供高神經(jīng)酸油。針對MoKCS基因，未來的研究可以將MoKCS基因導入目前油脂高產(chǎn)的植物中，通過MoKCS及超長鏈脂肪酸生物合成復合體合成神經(jīng)酸；同時，也可以將MoKCS導入目前已經(jīng)開發(fā)出來的高產(chǎn)油脂酵母中，通過酵母發(fā)酵的方式獲得神經(jīng)酸。最終為神經(jīng)酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定堅實的基礎。

4 結 論

本研究利用轉錄組測序技術首先獲得蒜頭果果實中KCS基因序列，并利用RT-PCR技術克隆獲得全長開放閱讀框MoKCS1，其全長1 539 bp，編碼含512個氨基酸，生物信息學分析結果顯示，MoKCS1含有KCS蛋白家族的保守結構域“FGNTSSSS”“GSGFKCNSAVW”和“GMGCSA”，與已報道的KCS具有高度一致性，表明該蛋白屬于KCS家族蛋白。蒜頭果KCS與榴蓮(Duriozibethinus)KCS的蛋白序列同源性最高，為80.66%，與芝麻(Sesamumindicum)和山黃麻(Tremaorientalis)KCS同源性分別為79.49%、78.72%。通過與NCBI中已知KCS構建分子進化樹分析，顯示MoKCS1非常特殊，自成一支，說明MoKCS1非常特殊。熒光定量PCR顯示MoKCS1在不同個體中以花謝3個月的蒜頭果果實表達量最高，而花謝3個月正是蒜頭果果實膨大期，神經(jīng)酸的累積期。這說明MoKCS1與蒜頭果神經(jīng)酸生物合成密切相關。