劉 正，王 靜，沈 偉，趙舒煊，袁文華，周海宇

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州 730030；

2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；

3.解放軍第九四三醫(yī)院特診科，甘肅 武威 733000

骨肉瘤是骨骼中常見的惡性腫瘤之一，主要見于兒童和青少年，并且與高度惡性、早期轉(zhuǎn)移、快速進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。骨肉瘤表現(xiàn)出高度惡性并且傾向于早期轉(zhuǎn)移：在新診斷的患者中經(jīng)常觀察到肺轉(zhuǎn)移，并且在沒有化療的情況下肺部癥狀可能在1年內(nèi)發(fā)展［1］。對于患有骨肉瘤的患者，目前大多數(shù)治療方案通常涉及強(qiáng)化新輔助化療，然后進(jìn)行手術(shù)切除。僅接受手術(shù)治療的高級別骨肉瘤患者的預(yù)后非常差，5年生存率低于20%［2］。骨肉瘤患者死亡的主要原因是肺轉(zhuǎn)移，預(yù)后差［3-5］。盡管臨床研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)步，但是其轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率仍然很高。EphA7是酪氨酸蛋白激酶受體家族中的重要成員之一，在多種組織或細(xì)胞中廣泛表達(dá)，對調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、遷移及血管形成具有潛在的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EphA7蛋白在一些惡性腫瘤中呈高表達(dá)和高活性，其在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［6-7］。本研究旨在觀察EphA7在骨肉瘤中的表達(dá)情況，了解EphA7對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 患者組織標(biāo)本

收集蘭州大學(xué)第二醫(yī)院2010年1月—2017年12月經(jīng)手術(shù)切除的骨肉瘤標(biāo)本45例，術(shù)前均未行放化療，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)。另取對應(yīng)45例瘤旁正常組織作為對照。將組織標(biāo)本立即在液氮中冷凍以供進(jìn)一步使用。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤MG-63細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。將人骨肉瘤MG-63細(xì)胞在含有10%胎牛血清（購自美國Hyclone公司）的MEM培養(yǎng)基（購自美國Hyclone公司）中培養(yǎng)，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞密度為90%時(shí)，棄去先前的培養(yǎng)基，隨后使用PBS對細(xì)胞進(jìn)行2次漂洗，然后用0.25%胰蛋白酶（購自美國Gibco公司）消化，將細(xì)胞在含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中制成單細(xì)胞懸浮液，并以規(guī)則的間隔傳代。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

計(jì)數(shù)對數(shù)生長期的細(xì)胞并接種到6孔板（每孔2×105個(gè)細(xì)胞）上，直到細(xì)胞匯合至60%～80%。根據(jù)制造商的說明，使用siRNA Reagent System試劑盒（購自美國Santa公司）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將6 μL EphA7-siRNA或陰性對照siRNA（購自美國Santa公司）轉(zhuǎn)染到MG-63細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)5～7 h。然后將細(xì)胞在含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24～48 h，用于以下實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為siRNA-EphA7組（EphA7-siRNA轉(zhuǎn)染）、siRNA-Control組（陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染）和空白組（未轉(zhuǎn)染）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測

使用TRIzol試劑（購自北京索萊寶科技有限公司），根據(jù)制造商的方案從組織或MG-63細(xì)胞中提取總RNA。使用紫外分光光度計(jì)測量260 nm/280 nm處的吸光度（D）值來檢測RNA的濃度和純度。D260nm/D280nm在1.7和2.1之間表明RNA具有高純度，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用PCR系統(tǒng)（購自瑞士Roche公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，LightCycler 96 RTFQPCR系統(tǒng)進(jìn)行RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)系統(tǒng)包括TB Green Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL、PCR正向引物（10 μmol/L）0.8 μL、PCR反向引物（10 μmol/L）0.8 μL、cDNA模板2.0 μL和滅菌蒸餾水6.4 μL。GAPDH作為內(nèi)部對照。EphA7的正義鏈為5’-CCTGAGGGATTGTAAC AGTCTT-3’，反義鏈為5’-GGTCACCTTG GGTAAAACTTTC-3’；GAPDH的正義鏈為5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3’，反義鏈為5’-TCCACCACCCAGTTGCTGTA-3’。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

使用蛋白質(zhì)裂解緩沖液（購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司），根據(jù)相關(guān)步驟從組織或MG-63細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)。用BCA試劑盒（購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測定總蛋白質(zhì)濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離總蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜（購自廣州賽國生物科技有限公司），并用5%脫脂牛奶封閉2 h，然后在4 ℃下將其與一抗（EphA7，1∶1 000稀釋；β-action，1∶500稀釋）（購自美國Santa公司）溫育過夜。將膜洗3次，每次15 min，然后與二抗（羊抗鼠IgG，1∶8 000稀釋）（購自美國Santa公司）一起溫育2 h。采用電化學(xué)發(fā)光ECL（購自美國Advansta公司）檢測Western blot條帶。使用Image J軟件以β-actin作為內(nèi)部參照分析靶蛋白的相對水平。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）測定

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后用0.25%胰蛋白酶消化以制備單細(xì)胞懸浮液。計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞接種到96孔板（每孔3×103～6×103個(gè)細(xì)胞，200 μL）上，5個(gè)重復(fù)孔。將細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48和72 h后，從培養(yǎng)箱中取出，每孔加入10 μL CCK-8（購自日本Dojindo公司）。然后，將細(xì)胞再培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀（購自美國Awareness公司）在450 nm處檢測每個(gè)孔的D值。在橫坐標(biāo)上繪制細(xì)胞生存曲線，在縱坐標(biāo)上繪制D值。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染48 h后，將人骨肉瘤MG-63細(xì)胞接種到6孔板上，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～100%時(shí)，使用200 μL移液管尖端在6孔底部進(jìn)行5次垂直劃痕。將6孔板用PBS洗滌2次以洗去漂浮的細(xì)胞，然后更換新鮮無血清培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。0和24 h時(shí)在倒置顯微鏡下分別拍照，觀察并測量劃痕的寬度。使用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。劃痕的愈合率=［（0 h的劃痕寬度－24 h的劃痕寬度）/0 h的劃痕寬度］×100%。

1.8 Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測

轉(zhuǎn)染48 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并收集到試管中。以1 000 r/min離心5 min后棄去上清液。用4 ℃的PBS清洗細(xì)胞3次，然后以1 000 r/min離心5 min后棄去上清液。根據(jù)Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）的說明，向每個(gè)管中加入150 μL結(jié)合緩沖液和5 μL Annexin V-FITC。在室溫下避光溫育15 min后，向管中補(bǔ)充結(jié)合緩沖液100 μL和PI 5 μL。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以x±s表示，組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨肉瘤組織及瘤旁正常組織中EphA7的mRNA表達(dá)

采用RTFQ-PCR檢測EphA7的mRNA在骨肉瘤及癌旁正常組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與瘤旁正常組織相比，骨肉瘤組織中EphA7的mRNA的表達(dá)量顯著增加（P＜0.05，圖1）。

圖 1 骨肉瘤組織與癌旁正常組織中EphA7的mRNA表達(dá)Fig. 1 mRNA expressions of EphA7 in osteosarcoma and adjacent normal tissues

2.2 骨肉瘤組織及癌旁正常組織中EphA7的蛋白表達(dá)

采用Western blot檢測在骨肉瘤及瘤旁正常組織中EphA7的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與瘤旁正常組織相比，骨肉瘤組織中EphA7的蛋白水平顯著增加（P＜0.05，圖2）。

圖 2 骨肉瘤組織及癌旁正常組織中EphA7的蛋白水平Fig. 2 Protein level of EphA7 in osteosarcoma and adjacent normal tissues

2.3 人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中EphA7的mRNA表達(dá)

采用RTFQ-PCR檢測人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中EphA7的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，siRNA-EphA7組與空白組和siRNA-Control組相比，MG-63細(xì)胞中mRNA的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），空白組與siRNAControl組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

圖 3 RTFQ-PCR檢測3組MG-63細(xì)胞中EphA7的mRNA表達(dá)Fig. 3 Detection of EphA7 mRNA expression in three groups of MG-63 cells by RTFQ-PCR

2.4 人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中EphA7的蛋白表達(dá)

采用Western blot檢測MG-63細(xì)胞中EphA7的蛋白水平。結(jié)果顯示，siRNA-EphA7組與空白組和siRNA-Control組相比，MG-63細(xì)胞中的蛋白水平顯著降低（P＜0.05），空白組與siRNA-Control組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

圖 4 Western blot檢測3組MG-63細(xì)胞中EphA7的蛋白水平Fig. 4 Western blot analysis of EphA7 protein level in three groups of MG-63 cells

2.5 EphA7對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響

在敲低EphA7的表達(dá)后，使用CCK-8測定以檢測MG-63細(xì)胞的增殖。構(gòu)建24、48和72 h的增殖曲線。結(jié)果顯示，siRNA-EphA7組中MG-63細(xì)胞增殖明顯減慢，與空白組和siRNA-Control組相比，siRNA-EphA7組在48和72 h時(shí)D值顯著降低（P＜0.05），在24 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。當(dāng)EphA7表達(dá)受到抑制時(shí)，MG-63細(xì)胞的增殖被顯著抑制（P＜0.05）?？瞻捉M與siRNA-Control組細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖 5 CCK-8檢測3組MG-63細(xì)胞的生長情況Fig. 5 The growth of three groups of MG-63 cells detected by CCK-8

2.6 EphA7對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷移的影響

培養(yǎng)24 h后，空白組和siRNA-Control組中MG-63細(xì)胞劃痕愈合率分別為（68.41±3.27）%和（66.74±2.63）%（P＞0.05），siRNA-EphA7組MG-63細(xì)胞的劃痕愈合率為（47.53±3.18）%，顯著低于空白組和siRNA-Control組（P＜0.05，圖6）。結(jié)果表明，EphA7表達(dá)的下調(diào)抑制了MG-63細(xì)胞的遷移。

2.7 EphA7對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測敲低EphA7表達(dá)后MG-63細(xì)胞數(shù)的凋亡?？瞻捉M、siRNA-Control組和siRNA-EphA7組的凋亡率分別為（17.62±1.25）%、（18.23±1.27）%和（29.59±1.64）%。與空白組和siRNA-Control組相比，siRNA-EphA7組MG-63細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。空白組和siRNA-Control組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖7）。說明EphA7表達(dá)的下調(diào)顯著促進(jìn)MG-63細(xì)胞的凋亡。

3 討 論

EphA7作為Eph家族的重要一員，定位于染色體6q-16.1上，最早是由Ciossek等于1995年在鼠類的神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的，他們還發(fā)現(xiàn)了若干個(gè)剪接變異體。隨后，研究者們在人類胎兒腦組織的cDNA文庫中也分離出EphA7受體［8］，另有研究者發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于人體組織中［9］。

以往對EphA7的研究多集中在生物體正常生理過程中的信號傳遞，以及胚胎和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等生理問題，其在血管的形成、腫瘤的發(fā)生及腫瘤血管形成中的研究相對較少。近年來，有研究者在多種腫瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)，EphA7與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。關(guān)于EphA7在腫瘤中的作用，目前也得出了一些相互矛盾的結(jié)論。有研究認(rèn)為EphA7是腫瘤抑制因子：Oricchio等［10］研究發(fā)現(xiàn)，EphA7在72%的濾泡性淋巴瘤中失活，敲除EphA7可以驅(qū)動(dòng)小鼠濾泡性淋巴瘤模型中的淋巴瘤發(fā)展；Wang等［11］研究發(fā)現(xiàn)，EphA7在結(jié)腸癌和多種結(jié)腸癌細(xì)胞系中低表達(dá)，過表達(dá)后可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；此外，Li等［12］也發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織和前列腺癌細(xì)胞系中EphA7低表達(dá)，調(diào)高EphA7表達(dá)后，可延遲前列腺癌細(xì)胞增殖，并可抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在另一些研究中則得出相反的結(jié)論：Wang等［13］描述了EphA7在胃癌樣本中的差異表達(dá)及EphA7表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性，對52例胃癌標(biāo)本中的EphA7進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)該蛋白水平與其轉(zhuǎn)錄水平一致，該蛋白在年輕患者和晚期腫瘤患者中顯著升高；Xiang等［14］發(fā)現(xiàn)，在喉癌細(xì)胞系中EphA7表達(dá)增高，下調(diào)EphA7基因的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，EphA7基因表達(dá)下降則促進(jìn)細(xì)胞凋亡；最近有研究表明［15］，與健康的肝臟組織相比，EphA7的mRNA在肝細(xì)胞癌中顯著上調(diào)，并且EphA7在肺癌中也被轉(zhuǎn)錄激活。

在骨肉瘤中EphA7的作用是否與上述表現(xiàn)一致，通過本實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)，EphA7在骨肉瘤組織中的表達(dá)上調(diào)，在體外研究中，EphA7-siRNA可顯著敲低人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中EphA7的表達(dá)，在MG-63細(xì)胞中敲低EphA7可抑制MG-63細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)其凋亡。因此，EphA7在調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞生長、遷移和凋亡中具有關(guān)鍵作用，其可能作為人骨肉瘤治療中的潛在治療靶標(biāo)或預(yù)測指標(biāo)。EphA7有可能是骨肉瘤的一個(gè)新的標(biāo)志物，對其結(jié)構(gòu)和功能的深入研究有望為防治骨肉瘤提供新思路。但是要將這些指標(biāo)應(yīng)用于臨床，還需要大量的樣本進(jìn)行深入研究，必須結(jié)合其他因素進(jìn)行多指標(biāo)、多因素綜合分析，EphA7在骨肉瘤中的作用方式及其機(jī)制也需要深入研究。