杭海芳，王瑩瑩，唐 勇，莊 衍，勵菁菁，朱 琦

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院血液內(nèi)科，上海 200011

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是漿細(xì)胞惡性克隆增殖性疾病，近年來隨著分子靶向藥物及造血干細(xì)胞移植等細(xì)胞免疫療法成功應(yīng)用于MM治療，MM患者的緩解率和無病生存率較以往顯著提高，然而仍有相當(dāng)一部分患者在緩解后復(fù)發(fā)并對多種藥物產(chǎn)生耐藥，屬于復(fù)發(fā)/難治性病例。因此，尋找MM新型藥物治療模式有其必要性和重要的臨床意義。已有研究顯示，三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多條信號通路介導(dǎo)MM細(xì)胞增殖阻滯和凋亡，但As2O3單藥的臨床療效有限［1］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）濃度不僅可以誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡，而且能夠增強MM常用臨床藥物（如硼替佐米）的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)［2］。鑒于此，本研究以MM細(xì)胞株U266細(xì)胞為模型，探討As2O3單獨和聯(lián)合cAMP擬似物8-對氯苯硫基環(huán)腺苷酸［8-(4-chlorophenylthio) adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate，8-CPT-cAMP］處理對MM細(xì)胞的影響及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 試劑

As2O3（由上海血液學(xué)研究所惠贈）用PBS配制成5 mmol/L儲存液。8-CPT-cAMP（購自美國Abcam公司）溶于水中配制成濃度為50 mmol/L的儲存液。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

MM細(xì)胞株U266細(xì)胞由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室提供。將2×105個/mL U266細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和2 mmol/mL谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基（購自美國Sigma公司）中，常規(guī)條件下培養(yǎng)（37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、95%濕度）48 h后抽取部分細(xì)胞用Shandon Cytospin 4細(xì)胞離心涂片機（購自美國Thermo Fisher Scientific公司）進行涂片，瑞士藍染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)，并以Image-Pro Plus軟件拍攝圖像。

1.3 細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測細(xì)胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期的U266細(xì)胞，按5×104個/ mL接種于96孔板，每孔100 μL。實驗組分別單獨及聯(lián)合用0.50、1.00 μmol/L As2O3和200 μmol/L 8-CPT-cAMP處理U266細(xì)胞。同時設(shè)溶劑對照組和空白對照組，每組3個復(fù)孔。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72和120 h后每孔分別加入10 μL CCK-8溶液（購自日本同仁化學(xué)研究所），混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀振蕩，以空白對照孔調(diào)零，測450 nm處各孔吸光度（D）值。細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-D實驗組/D對照組）×100%進行計算。應(yīng)用Chou-Talalay中效分析法，由CompuSyn軟件計算出各處理組細(xì)胞效應(yīng)分?jǐn)?shù)（fraction affected，F(xiàn)a，即藥物處理后細(xì)胞生長抑制率）相應(yīng)的藥物聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI），并繪制Fa-CI曲線，當(dāng)CI＜1，表示兩藥有協(xié)同作用；CI=1，表示兩藥有疊加作用；CI＞1，表示兩藥為拮抗作用。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡率

1.4.1 細(xì)胞周期檢測

分別收集上述單獨及聯(lián)合用0.50、1.00 μmol/L As2O3和200 μmol/L 8-CPT-cAMP處理的U266細(xì)胞，PBS洗滌后加入75%乙醇溶液，-20 ℃固定過夜；加入1×PBS 10 mL混勻，2 500 r/min離心5 min（離心半徑為8.5 cm），洗滌2次，分別加入100 mg/mL核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）37 ℃溫育30 min；采用100 μg/mL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。所有數(shù)據(jù)用美國Beckman Coulter公司的Multicycle軟件收集、存儲和分析。

1.4.2 細(xì)胞凋亡率檢測

根據(jù)Annexin-V/FITC凋亡檢測試劑盒（購自美國BD公司）說明，將不同處理組細(xì)胞以PBS洗滌后加入1 mL結(jié)合緩沖液，漂洗細(xì)胞1次。依次加入100 μL結(jié)合緩沖液及3 μL Annexin-V/FITC，重懸混勻，避光溫育15 min，再加入3 μL PI，避光溫育3 min，每管加入結(jié)合緩沖液400 μL，1 h內(nèi)進行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達

在PBS洗滌后的各組U266細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍定量后，取各組等量總蛋白進行十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜；膜經(jīng)室溫5%脫脂牛奶封閉1 h，加入相應(yīng)一抗（包括Bcl-2和caspase-3），4 ℃過夜；經(jīng)含0.1%Tween-20的PBS充分洗滌后與相應(yīng)稀釋度的二抗室溫下反應(yīng)1 h，應(yīng)用ECL試劑盒（購自英國Amersham Pharmacia Biotech公司）顯影掃描保存。所用抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料用x±s表示，檢驗方差齊性，兩組均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差（ANOVA）分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 As2O3和8-CPT-cAMP單獨及聯(lián)合對U266細(xì)胞生長的影響

MM細(xì)胞株U266細(xì)胞經(jīng)1.00 μmol/L As2O3和200 μmol/L 8-CPT-cAMP單獨及聯(lián)合處理72和120 h后，聯(lián)合用藥組所誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制率分別達到（18.01±0.13）%和（28.01±0.14）%，明顯高于單獨用藥組［As2O3單藥組細(xì)胞生長抑制率為（11.35±0.01）%和（16.01±0.14）%，8-C P T-c A M P單藥組細(xì)胞生長抑制率為（12.26±0.30）%和（15.43±0.23）%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。但不同濃度As2O3（0.25、0.50和1.00 μmol/L）單獨及聯(lián)合8-CPT-cAMP（200、300和400 μmol/L）處理U266細(xì)胞后生長抑制率和相應(yīng)藥物濃度應(yīng)用CompuSyn軟件分析，結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合處理U266細(xì)胞的CI值均＞1（表2和圖1）。形態(tài)學(xué)觀察顯示，單藥組及聯(lián)合處理組細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞質(zhì)濃縮、核固縮和碎裂等典型凋亡形態(tài)學(xué)改變，單藥組及聯(lián)合用藥組處理后細(xì)胞形態(tài)無顯著變化（圖2）。

表 1 As2O3單獨及聯(lián)合8-CPT-cAMP對U266細(xì)胞生長的影響Tab. 1 Effect of As2O3 alone or combined with 8-CPT-cAMP on the survival of U266 cells(%, ±s)

表 1 As2O3單獨及聯(lián)合8-CPT-cAMP對U266細(xì)胞生長的影響Tab. 1 Effect of As2O3 alone or combined with 8-CPT-cAMP on the survival of U266 cells(%, ±s)

Group Sample number n Growth inhibition rate Cell apoptotic rate 72 h 120 h 72 h 120 h Control 3 5.65±0.15 8.98±0.01 5.51±0.06 8.98±0.01 As2O3 3 11.35±0.01 16.01±0.14 10.06±0.01 12.35±0.14 8-CPT-cAMP 3 12.26±0.30 15.43±0.23 13.26±0.30 18.76±0.23 As2O3+8-CPT-cAMP 3 18.01±0.13 28.01±0.14 22.26±0.13 31.03±0.14

表 2 As2O3聯(lián)合8-CPT-cAMP對U266細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)Tab. 2 Inhibitory effects of As2O3 combined with 8-CPT-cAMP on the proliferation of U266 cells

圖 1 As2O3聯(lián)合8-CPT-cAMP抑制U266細(xì)胞增殖的協(xié)同效應(yīng)曲線Fig. 1 The Fa-CI plot of As2O3 combined with 8-CPT-cAMP on the proliferation of U266 cells

圖 2 As2O3和8-CPT-cAMP單獨及聯(lián)合處理U266細(xì)胞后形態(tài)學(xué)變化Fig. 2 Effects of As2O3 alone and combined with 8-CPT-cAMP on the morphologic changes of U266 cells

2.2 As2O3和8-CPT-cAMP對U266細(xì)胞凋亡率的影響

Annexin-V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的結(jié)果顯示，U266細(xì)胞經(jīng)1.00 μmol/ L As2O3和200 μmol/L 8-CPT-cAMP單藥及聯(lián)合處理72和120 h后，As2O3單藥組細(xì)胞凋亡率為（10.06±0.01）%和（12.35±0.14）%，8-CPT-cAMP單藥組細(xì)胞凋亡率為（13.26±0.30）%和（18.76±0.23）%，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率分別達到（22.26±0.13）%和（31.03±0.14）%，顯著高于單藥組（P＜0.05，表1）。

2.3 As2O3和8-CPT-cAMP對U266細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控蛋白表達的影響

用As2O3和8-CPT-cAMP單獨及聯(lián)合處理U266細(xì)胞72 h后，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)caspase-3和Bcl-2蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，As2O3單藥及聯(lián)合8-CPT-cAMP可以使細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白發(fā)生剪切活化，同時下調(diào)Bcl-2蛋白表達水平，其中聯(lián)合用藥組caspase-3蛋白剪切活化和Bcl-2蛋白表達下調(diào)更為明顯，而8-CPT-cAMP單藥對細(xì)胞內(nèi)caspase-3和Bcl-2表達均無明顯影響（圖3）。

圖 3 As2O3和 8-CPT-cAMP對U266細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控蛋白表達的影響Fig. 3 Effects of As2O3 and 8-CPT-cAMP on the expression of apoptosis modulator in U266 cells

3 討 論

MM作為高度異質(zhì)性漿細(xì)胞腫瘤，由于腫瘤細(xì)胞克隆演變導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)并產(chǎn)生對現(xiàn)有治療方案的耐藥［3］，積極探究新型有效藥物和作用模式成為進一步提高MM臨床療效和改善其預(yù)后的主要途徑。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，As2O3和cAMP擬似物8-CPT-cAMP通過調(diào)節(jié)MM細(xì)胞內(nèi)多個信號調(diào)控分子（如SOCS-1、Bcl-2和Bax等）誘導(dǎo)其增殖阻滯和凋亡，但同時也發(fā)現(xiàn)As2O3和8-CPT-cAMP單藥作用有限及所需劑量較高等問題［4-5］。有鑒于此，本研究采用As2O3與8-CPT-cAMP聯(lián)合處理MM細(xì)胞株U266細(xì)胞，觀察兩藥聯(lián)合對MM細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

本研究顯示，As2O3與8-CPT-cAMP單藥均可以抑制U266細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡，這與已有的相關(guān)研究結(jié)果一致［6-7］。但兩藥聯(lián)合對U266細(xì)胞增殖阻滯和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)明顯高于單獨用藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時應(yīng)用CompuSyn軟件分析，結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合的CI值＞1，說明As2O3與8-CPT-cAMP在抑制U266細(xì)胞增殖過程中協(xié)同效應(yīng)并不明顯。此外，單藥和兩藥聯(lián)合處理72 h后的U266細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)核固縮和凋亡小體等典型凋亡表現(xiàn)，單藥組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞形態(tài)也無明顯變化。Western blot對凋亡相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果也進一步顯示，聯(lián)合用藥組U266細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白剪切活化和Bcl-2表達下調(diào)，與As2O3和8-CPT-cAMP單藥組比較有明顯差異。上述結(jié)果提示，8-CPT-cAMP能夠增強As2O3誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡，但協(xié)同效應(yīng)不明顯。

經(jīng)典細(xì)胞凋亡主要包括線粒體途徑和死亡受體途徑，兩條途徑最終都是通過激活caspases誘導(dǎo)凋亡，其中caspase-3是凋亡過程中重要的終末剪切酶。Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)，As2O3單藥或聯(lián)合8-CPT-cAMP能夠誘導(dǎo)U266細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達下調(diào)和caspase-3剪切活化，提示As2O3單藥或聯(lián)合8-CPT-cAMP可能是通過細(xì)胞內(nèi)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。前期研究也顯示，As2O3和8-CPT-cAMP均可以改變MM細(xì)胞線粒體跨膜電位而通過線粒體途徑誘導(dǎo)其凋亡［2，9］，但二者合用協(xié)同效應(yīng)不明顯是否與線粒體作用位點疊加甚至拮抗有關(guān)，有待進一步深入研究。

綜上所述，As2O3聯(lián)合8-CPT-cAMP可能通過線粒體途徑促使MM細(xì)胞增殖阻滯和凋亡。8-CPT-cAMP可以增強As2O3凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，但協(xié)同效應(yīng)不明顯，有必要進一步篩選更為有效的新型組合。