溫娟娟,王超楠,華德平,張 紅,徐營(yíng)莉,張 斌

(1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,天津 300387；2.天津科潤(rùn)蔬菜研究所 蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300381；3.天津大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,天津 300072)

目前,根腫病在全世界發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重,根腫病是蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron.)侵染十字花科植物根部而引起的,根部細(xì)胞異常增殖,形成腫塊,進(jìn)而影響水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸,造成植株地上部分枯萎,直至全株死亡[1]。隨著機(jī)械農(nóng)具的使用,根腫病傳播更加迅速,已成為影響我國(guó)大白菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害。蕓薹根腫菌是一種專性土壤寄生的原生生物[2],不同地區(qū)根腫菌之間存在分化現(xiàn)象[3]。國(guó)際上通用的鑒定系統(tǒng)是Williams[4]鑒別系統(tǒng)和ECD[4](European clubroot differential set)鑒別系統(tǒng),最常用的是Williams 鑒別系統(tǒng)。目前,我國(guó)存在的蕓薹根腫菌生理小種有1,2,4,7,9,10,11,12,13等[5-10],其中4,7,10,11號(hào)最常見(jiàn)。

已報(bào)道的大白菜抗根腫病基因有8個(gè),其中,CRa[11]、CRb[12]、Crr3[13]、CRk[14]和CRc[14]為質(zhì)量性狀位點(diǎn),Crr1、Crr2[15]和Crr4[16]為數(shù)量性狀位點(diǎn),Crr1為主效基因,Crr2為修飾基因,而Crr4為微效基因[16],除Crr4外其他7個(gè)基因均已開(kāi)發(fā)出連鎖標(biāo)記。多重PCR是指在一次PCR擴(kuò)增中使用2對(duì)或者2對(duì)以上的引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段,具有高效、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在多重PCR已經(jīng)廣泛用于玉米[17]等經(jīng)濟(jì)作物,應(yīng)用價(jià)值很高。

目前,不同大白菜材料對(duì)不同根腫菌生理小種的抗病性還不明確,本研究以我國(guó)大白菜產(chǎn)區(qū)主要存在的4,7,10,11號(hào)小種為菌源,同時(shí)利用已報(bào)道的13個(gè)主要抗根腫病 (CR)分子標(biāo)記對(duì)供試大白菜進(jìn)行抗病性鑒定和抗病位點(diǎn)檢測(cè),為這些品種在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。同時(shí)試驗(yàn)還進(jìn)行了多重PCR技術(shù)在大白菜中的應(yīng)用研究,旨在推進(jìn)簡(jiǎn)便、高效的PCR技術(shù)在大白菜中進(jìn)行應(yīng)用,提高大群體分子檢測(cè)的工作效率。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取國(guó)內(nèi)19個(gè)商業(yè)品種及6份自交系為試驗(yàn)材料,材料名稱和來(lái)源詳見(jiàn)表1。4個(gè)生理小種分別采自湖北長(zhǎng)陽(yáng)賀家坪、湖北利川、四川西昌市安寧鎮(zhèn)和遼寧沈陽(yáng)(表2),收集根瘤,洗凈晾干,-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液的制備 對(duì)根瘤進(jìn)行檢查,確保存在休眠孢子囊,4層紗布過(guò)濾攪碎后的根腫瘤組織,4 000 r/min離心10 min,倒掉上清液,蒸餾水懸浮沉淀后離心3次。將制備好的孢子懸浮液濃度調(diào)至 1×107～1×108個(gè)/mL,4 ℃保存?zhèn)溆肹18]。

表2 供試菌種來(lái)源和類型Tab.2 Sampling sites and pathotypes of P. brassicae field populations

1.2.2 接種方法 將種子播在裝有消毒土的穴盤(pán)中,用移液槍吸取1 mL 根腫菌液,注射種子周圍,少量蛭石覆蓋。苗盤(pán)置于溫室通風(fēng)陰涼處,25 ℃下生長(zhǎng),苗盤(pán)下保持1 cm水層,30 d后調(diào)查發(fā)病情況。每個(gè)材料播種25穴,重復(fù)3次。

1.2.3 調(diào)查方法 接種菌液培養(yǎng)30 d后,將大白菜材料根部沖洗干凈并調(diào)查發(fā)病情況,取3個(gè)重復(fù)的平均值計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù),計(jì)算方法如下[5]：

病株率=(發(fā)病株數(shù)/總株數(shù))×100%；

病情指數(shù)=∑(發(fā)病級(jí)代表值×各級(jí)病株數(shù))×100/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)發(fā)病代表值)。

1.2.4 大白菜根腫病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 根腫病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照曾令益等[19]的報(bào)道,病情指數(shù)DI≤10記為抗病(R),1030記為高感(HS)。

1.2.5 抗病位點(diǎn)檢測(cè) 出苗10 d后,每個(gè)材料取3株真葉,利用CTAB法[20]提取大白菜葉片的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),采用 10 μL PCR反應(yīng)體系：5 μL的2×TaqMaster mix,上、下游引物10 μmol/L各0.4 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 3.2 μL。PCR反應(yīng)程序參考文獻(xiàn)[13,16,19,21]中的方法進(jìn)行,無(wú)菌水作為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將條帶大于300 bp的引物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,小于300 bp的引物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳?？垢[病位點(diǎn)引物序列見(jiàn)表3。

表3 大白菜抗根腫病位點(diǎn)的引物序列Tab.3 List of primers used for detection of clubroot resistant locus in Chinese cabbages

注：*.來(lái)自大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)。

Note：*.From http://brassicadb.org/brad/.

1.2.6 大白菜多重PCR體系的建立 采用PCR產(chǎn)物混合法和引物混合法對(duì)大白菜兩重SSR-PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行摸索。PCR產(chǎn)物混合法：?jiǎn)我灰锏腜CR 產(chǎn)物各取2 μL,混合均勻之后進(jìn)行點(diǎn)樣；引物混合法：同一反應(yīng)體系中加入不同的引物,其他成分與單一引物PCR反應(yīng)中加入的量相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜材料人工接種鑒定結(jié)果

由表4可知,供試大白菜材料中,德高CR117、CR詠春、水師營(yíng)18號(hào)、CR京秋新三號(hào)、德高CR鐵甲1號(hào)、大地CR118和秋綠60 7份材料對(duì)4個(gè)生理小種都表現(xiàn)感病,其中德高CR117、CR詠春、德高CR鐵甲1號(hào)和大地CR118表現(xiàn)為低感,而秋綠60接種4個(gè)菌株后均在主根上形成大的根瘤,發(fā)病癥狀明顯,均表現(xiàn)為高感；山地王2號(hào)、星光、CR春泰、CR-強(qiáng)漢、京春CR3、CR福將、15B178和12G57 8份材料對(duì)4個(gè)生理小種都表現(xiàn)抗?。籆1、C3、CR75和15B172 4份材料對(duì)2個(gè)生理小種表現(xiàn)感病,其中 C1、C3和15B172對(duì)4號(hào)生理小種高感,對(duì)7號(hào)生理小種低感；CR75對(duì)4號(hào)和11號(hào)生理小種低感；華抗301、CR開(kāi)拓16號(hào)、清江春福CR、15B201、15B225和 12G83 6份材料只對(duì)4號(hào)生理小種低感,對(duì)其他3個(gè)生理小種抗病。

由此可見(jiàn),供試大白菜中,有8份材料對(duì)4號(hào)生理小種表現(xiàn)為抗病,有15份材料對(duì)7號(hào)生理小種表現(xiàn)為抗病,18份材料對(duì)10號(hào)生理小種表現(xiàn)為抗病,17份材料對(duì)11號(hào)生理小種表現(xiàn)為抗病。從病原的致病力強(qiáng)弱來(lái)看,4號(hào)生理小種為最強(qiáng),其次為7號(hào)生理小種。

表4 供試大白菜材料人工接種鑒定結(jié)果Tab.4 The identification results of artificial inoculating in Chinese cabbages

注：R.抗?。籐S.低感；HS.高感。

Note： R.Resistant; LS.Low susceptible; HS.High susceptible.

表5 供試大白菜材料分子標(biāo)記鑒定結(jié)果Tab.5 Identification results of molecular markers in Chinese cabbages

注：“+ ”.純合抗病位點(diǎn);“- ”.純合感病位點(diǎn);“± ”.雜合抗病位點(diǎn)。

Note： "+" . Homozygous resistant site; "-".Homozygous susceptible site; "±".Heterozygous resistant site.

2.2 大白菜材料分子標(biāo)記鑒定結(jié)果

目前國(guó)內(nèi)對(duì)大白菜材料中含有的抗病位點(diǎn)研究較少,通過(guò)抗病性和分子標(biāo)記檢測(cè),找到兩者之間的關(guān)系。利用已報(bào)道的與抗病基因連鎖的13個(gè)分子標(biāo)記對(duì)供試大白菜進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)到Crr1、Crr2、Crr3、CRk、CRa、CRb和CRc共7個(gè)抗病位點(diǎn)(表5)。全部材料都檢測(cè)到含有Crr1抗病位點(diǎn),但是不同引物對(duì)同一材料的判定結(jié)果不同；在德高CR117、CR春泰、CR-強(qiáng)漢、CR詠春、C1、華抗301、CR開(kāi)拓16號(hào)、清江春福CR、秋綠60、15B225和12G83 11份材料中發(fā)現(xiàn)含有Crr2抗病位點(diǎn),其中德高CR117、CR春泰、CR開(kāi)拓16號(hào)、清江春福CR、秋綠60、15B225和12G83 7份材料中為純合位點(diǎn)；只有京春CR3中檢測(cè)到Crr3位點(diǎn),除德高CR鐵甲1號(hào)和大地CR118外,其他試材中均含有CRk抗病位點(diǎn)；21，16份試材分別檢測(cè)到抗病位點(diǎn)CRa和CRb,且大多為雜合位點(diǎn),僅在部分試材中檢測(cè)到純合抗病位點(diǎn)；星光和CR75含有CRc抗病位點(diǎn),其他材料中均未檢測(cè)到這個(gè)位點(diǎn)。

大部分試材中并不是只含有1個(gè)抗病位點(diǎn),星光、CR春泰、CR詠春、京春CR3、C1、CR75、CR開(kāi)拓16號(hào)和清江春福CR 8份試材含有5個(gè)抗病位點(diǎn)；德高CR117、山地王2號(hào)、CR-強(qiáng)漢、水師營(yíng)18號(hào)、CR京秋新三號(hào)、C3、CR福將、秋綠60、15B172、15B178、15B225和12G57 12份試材含有4個(gè)抗病位點(diǎn)；華抗301、15B201和12G83 3份試材含有3個(gè)抗病位點(diǎn)；只有德高CR鐵甲1號(hào)和大地CR118含有1個(gè)抗病位點(diǎn)。

2.3 大白菜多重PCR反應(yīng)體系的建立

多重PCR在大白菜中并未使用,它能節(jié)省材料,提高擴(kuò)增速率。根據(jù)2個(gè)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶差異大和退火溫度相同的選擇原則,將BrID11233和B0902聚合在一起。圖1為引物BrID11233和B0902兩重PCR組合產(chǎn)物混合法(A)和引物混合法的擴(kuò)增結(jié)果(B)。

根據(jù)兩重PCR組合產(chǎn)物混合法(A)和引物混合法的擴(kuò)增結(jié)果(B)發(fā)現(xiàn),引物BrID11233和B0902所擴(kuò)增條帶與單一的PCR反應(yīng)擴(kuò)增的條帶一致,且能夠清晰的區(qū)分開(kāi),表明這2個(gè)引物可以成功的聚合在一起。

M.Marker;H1-H4.材料編號(hào)：分別為2,6,7,17號(hào)材料。M.Marker;H1-H4.Material number：Materials of 2, 6, 7，17.

3 結(jié)論與討論

汪維紅等[5]表明,Williams鑒別系統(tǒng)的 4 號(hào)小種因?yàn)橹虏×ψ顝?qiáng),分布最廣,所以是我國(guó)根腫菌的優(yōu)勢(shì)小種。本研究發(fā)現(xiàn)：對(duì)4號(hào)生理小種感病的大白菜材料多于對(duì)其他3個(gè)生理小種感病的材料,其中華抗301、CR開(kāi)拓16號(hào)、清江春福CR、15B201、15B225和 12G83等材料只對(duì)4號(hào)生理小種感病,這也印證了前人的研究結(jié)果。CRb基因?qū)ι硇》N2,4,8號(hào)有抗性[13],本研究與其研究結(jié)果不一致,部分含有CRb基因的試材(如清江春福CR)對(duì)4號(hào)生理小種表現(xiàn)感病。可能由于同一地方存在多個(gè)生理小種混雜的情況,恩施地區(qū)同一田塊存在不同的生理小種[19]。故推測(cè)湖北長(zhǎng)陽(yáng)賀家坪所取病源菌不僅有4號(hào)生理小種,還可能存在其他生理小種。

抗病位點(diǎn)CRa、CRb、Crr3和CRk都位于A03號(hào)染色體上,關(guān)于它們的位置一直都存在爭(zhēng)議,CRa和CRb也許是2個(gè)獨(dú)立基因[22],也許是連鎖緊密的2個(gè)抗病位點(diǎn)[11-12]。Sakamoto 等[14]研究表明,CRk和Crr3是2個(gè)位置很近的獨(dú)立的抗病位點(diǎn),本研究發(fā)現(xiàn)在CR-強(qiáng)漢中只檢測(cè)到CRa而未檢測(cè)到CRb。同時(shí),像德高CR117等材料中均含有CRk,但不含有Crr3,只有京春CR3同時(shí)含有Crr3和CRk,德高CR鐵甲1號(hào)和大地CR118未檢測(cè)到含有Crr3和CRk。這說(shuō)明CRa、CRb、Crr3和CRk應(yīng)該是4個(gè)相互獨(dú)立的基因。

抗病位點(diǎn)越多的材料抗病性越強(qiáng)[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)德高CR鐵甲1號(hào)和大地CR118對(duì)4個(gè)生理小種均表現(xiàn)感病,而且這2個(gè)材料只含有Crr1基因,印證了前人的結(jié)果。除了這2個(gè)材料之外其他試材并不符合這個(gè)關(guān)系。同時(shí),C1和C3這2個(gè)品種的抗病性鑒定結(jié)果一樣,但是分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),C1中檢測(cè)到含有Crr2,C3 中未檢測(cè)到,推測(cè)Crr2抗病位點(diǎn)對(duì)于品種的抗病性影響不大。

所有材料中均含有Crr1抗病位點(diǎn),但其對(duì)材料抗性影響不大。Suwabe等[16]研究發(fā)現(xiàn),Crr2和Crr4基因的存在能夠增強(qiáng)Crr1基因的抗病能力,且含有純合抗性基因的植株比雜合基因植株的抗根腫病能力強(qiáng)。在本次試驗(yàn)中未檢測(cè)Crr4位點(diǎn),對(duì)結(jié)果有一定影響。除此之外在數(shù)量性狀的遺傳中,抗病基因之間的相互關(guān)系會(huì)影響到性狀表達(dá)。李朋朋等[23]研究發(fā)現(xiàn)，等位基因間的互作對(duì)根腫病的抗性有重要的影響。

以往大白菜的PCR擴(kuò)增體系都是1次反應(yīng)中使用1對(duì)引物,本研究發(fā)現(xiàn)在大白菜中,可以建立擴(kuò)增效果良好的多重PCR體系,這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用不僅可以節(jié)省材料,還能提高大白菜大群體分子檢測(cè)的工作效率。