張夢瑤，楊 峰，劉積鳳，劉開東，賀建寧，柳 楠

(1.青島農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山東 青島 266109；2.青島畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266121；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

我國在20世紀80年代開始育種細毛羊，其中的敖漢細毛羊在敖漢、翁牛特旗縣開始繁育，父母系均來自于不同的細毛羊品種，父本通常以美利奴羊為主[1]。毛囊是皮膚的一附屬結構，它的形成是上皮細胞和真皮細胞間相互作用的結果。在羊毛產(chǎn)量上皮膚和毛囊的性狀起到了重要的作用，因此了解皮膚結構和毛囊的發(fā)育規(guī)律對細毛羊生產(chǎn)顯得尤為重要[2]。毛囊的調控也受多種因子影響，因此探究毛囊生長發(fā)育的調控基因也顯得非常重要。

Hox(Homeobox)基因又稱為同源異型盒基因(Homeotic gene)，是胚胎復雜的遺傳系統(tǒng)的中心，在胚胎發(fā)育過程中，它通過相應的信號指揮胚胎的發(fā)生[3]，發(fā)出信號作用于不同部位的細胞，使得細胞在分化的過程中接收到來自Hox基因的信號，能夠保證各個部位分化出正常的組織和器官，是發(fā)育遺傳學研究的前沿陣地[4]。Hox家族是動物基因組內(nèi)高度保守的一類轉錄因子[5]，目前共有39個[6]，不但在動物體軸形成過程中扮演著重要的角色，對毛囊細胞增殖分化也起著重要作用[7-9]，是一類重要的發(fā)育調控基因。通過對人和小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)Hox家族的基因均在皮膚和毛囊中表達[10]。Hoxa5能夠對毛囊細胞的增殖、分化發(fā)出信號[9]，從而能夠阻斷毛囊在退行期時的其他信號的傳遞，延滯了毛囊的周期發(fā)育[11]。Hox基因數(shù)目多少、序列的多樣性及其表達模式直接決定了動物的生態(tài)多樣性，因此Hox基因在模式生物系統(tǒng)中的研究相對較廣泛。Hoxa5在控制毛生長發(fā)育中有重要作用，當缺少或過表達時，小鼠都會表現(xiàn)出毛生長的缺陷[12]。BMPs本身是一種蛋白，BMPs在骨的形成過程中發(fā)揮著重要的作用，通過誘導間充質干細胞使其分化成骨，也可以通過誘導促進脂肪細胞向骨細胞分化從而成骨，也有促進胚胎成纖維細胞的分化，進一步分化形成骨骼[13]。有研究表明，BMPs對毛囊細胞的發(fā)育也有一定的影響，初步得到對毛囊的發(fā)育是抑制作用，至于在哪個時期還有待研究。BMPR1B基因屬于BMPs家族的Ⅰ型受體因子，同樣它也調節(jié)神經(jīng)細胞、骨細胞等的代謝。近來在綿羊多產(chǎn)基因分子機制上的研究較多，表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其受體對動物卵泡發(fā)育具有重要影響。在毛囊生長發(fā)育上，BMPR1B基因在初級毛囊的毛母質、內(nèi)根鞘和毛干等均可以表達，在次級毛囊的內(nèi)根鞘和絨干也將表達[14]，這為研究提供了一定的基礎。

目前，在敖漢細毛羊身上基因的研究主要集中在肌肉方面，選取優(yōu)良基因對肌肉肌纖維粗細的影響，對于有關皮膚毛囊的基因研究還相對較少，有一部分研究也只局限在分子水平上，通過基因mRNA的表達量來初步判斷基因的作用；還有一部分是與毛囊無關的研究。本研究不僅從單個基因的mRNA水平和蛋白水平上對功能進行鑒定，并且著重對Hoxa5、BMPR1B兩基因之間的相互作用關系進行了鑒定，以分析兩者之間的上、下調關系，從而進一步為基因通路的研究提供一定的基礎，為基因在個體層次上的研究提供堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取健康40日齡的胎羊。

1.2 主要試驗試劑及儀器

PeM-T、pcDNA3.1質粒、Lipofectamine2000、高糖培養(yǎng)液等均購自青島鑫宇恒一有限公司。BB5060UV 型賀氏二氧化碳培養(yǎng)箱購于德國Eppendorf公司，Western Blot、熒光定量PCR系統(tǒng)均購自Bio-Rad公司[15]。

1.3 表達載體的構建

1.3.1 引物設計及擴增 從NCBI中查找綿羊的Hoxa5(GenBank登錄號為NM-015095103.2)、BMPR1B(GenBank登錄號為NM-001009431.1)基因全序列，選取Hoxa5基因和BMPR1B基因的CDS區(qū)，利用軟件Primer 5.0設計2個基因的引物。設計同時需在上下游引物5′端加入保護堿基和EcoR Ⅰ、KpnⅠ酶切位點，最終完成的Hoxa5引物序列為：

上游引物：5′-CCGGAATTCATGAGCTCTTATTTT GTAAAC-3′；

下游引物：5′-CGGGGTACCTAAACGCTCAAATA CTCAGG-3′。

在BMPR1B上下游引物5′端加入EcoR Ⅰ、NdeⅠ酶切位點，最終完成的引物序列為：

上游引物：5′-CCGGAATTCATGCTTCAGGTTTG CGAAGT-3′；

下游引物5′-GGAATTCCATATGTCAGATGTCC TGTCTAAGGG-3′[15]。

利用TRIzol裂解成纖維細胞，按照試劑盒說明提取細胞RNA，并將其反轉錄成cDNA。擴增體系為20 μL:DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，金牌Mix 17 μL。

1.3.2 TA克隆 對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳回收，對DNA片段進行加A，反應體系為：目的片段15 μL、Tailing-A ReactionBuffer 4 μL、TapDNA Polymerase 1 μL。TA克隆連接體系為：T4DNA連接酶2 μL、T4Buffer 1 μL、T載體2 μL、目的片段5 μL、水浴16 ℃ 3 h，4 ℃ 12 h。取50 μL DH5ɑ與5 μL T連接液混勻冰浴20 min；42 ℃熱激90 s，冰浴15 min；加入400 μL LB培養(yǎng)基(不含AMP抗生素)37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，去上清，將細胞均勻分散在含有AMP抗生素的培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置12 h，挑取單菌進行10 h搖菌[16]。

1.3.3Hoxa5、BMPR1B基因與pcDNA3.1質粒重組 對TA克隆載體分別進行EcoR Ⅰ、NdeⅠ雙酶切和EcoR Ⅰ、KpnⅠ雙酶切，酶切體系為：EcoRⅠ內(nèi)切酶1 μL；NdeⅠ內(nèi)切酶1 μL；KpnⅠ內(nèi)切酶1 μL；TA克隆載體和pcDNA3.1 5 μL；Buffer 1 μL加水補足到50 μL體系。37 ℃ 2 h，對Hoxa5、BMPR1B基因及切開的pcDNA3.1質粒進行膠回收，取Hoxa5、BMPR1B基因各5 μL，3 μL pcDNA3.1，加入1 μL T4DNA連接酶及1 μL T4DNA連接酶Buffer，22 ℃金屬浴2 h，16 ℃ 3 h，后轉入到DH5α感受態(tài)細胞中過夜培養(yǎng)，選取單個菌落進行搖菌，利用簡單PCR鑒定菌液中是否含有目的基因，對含有的菌液進行測序檢測[16]。

1.4 敖漢細毛羊成纖維細胞的培養(yǎng)

從懷孕的母體中取出完整的40日齡胎羊，用75%酒精對胎兒清洗幾遍，再用PBS進行清洗并保存。帶回細胞間后用75%的酒精清洗，再用含有雙抗的PBS清洗。對30日齡的胎羊只留軀干，將軀干分成直徑1.0～1.5 cm，并在分離的組織上滴加適當?shù)奶ヅＱ?，覆蓋組織即可，37 ℃，5.0% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，之后在培養(yǎng)基加入適當?shù)母咛桥囵B(yǎng)液。24 h后先觀察細胞生長情況，待細胞生長良好，則給細胞進行換培養(yǎng)液[15]。待細胞密度達95%，去除廢舊培養(yǎng)液用預熱含有雙抗的PBS洗滌幾遍，每個平板中加入1 mL的胰蛋白酶，放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中消化，當大量細胞由梭形變?yōu)閳A形時加入3 mL的培養(yǎng)液停止消化。根據(jù)細胞密度的大小進行分板，繼續(xù)加入新鮮的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細胞密度達95%后，再次進行傳代[16]。

1.5 細胞轉染

當細胞密度達90%左右時，去除舊的培養(yǎng)液，用不含抗生素的PBS清洗幾遍，利用Lipofectamine2000進行轉染，共轉染組和單轉染組分別取其20 μL脂質體試劑，加入480 μL DMEM(不含雙抗)，混勻，靜置5 min，在共轉染組中分別加入20 μL的Hoxa5、BMPR1B質粒，460 μL高糖培養(yǎng)基(不含雙抗)，單轉染組加40 μL質粒，460 μL高糖培養(yǎng)基，孵育15～20 min，加入4 mL 高糖培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)6 h，換含有雙抗的高糖培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)36 h[18]。

1.6 實時熒光PCR檢測

對轉染后細胞繼續(xù)正常培養(yǎng)48 h，當細胞密度達90%時收集細胞，去除培養(yǎng)基用PBS清洗幾遍，每平板中加入 3 mL的TRIzol裂解成纖維細胞，按照試劑盒說明提取細胞RNA。其濃度和純度處于正常范圍時對RNA進行反轉錄[15-16]，反轉錄成cDNA。通過NCBI查找綿羊Hoxa5、BMPR1B基因的CDS區(qū)和綿羊GAPDH的CDS區(qū)，利用PrimerPremier 5.0分別設計Hoxa5、BMPR1B和GAPDH基因的特異性熒光定量引物，序列如表1。

利用設計的熒光定量引物和反轉錄的cDNA對2個基因進行定量檢測。試驗組和對照組各設置3次重復，2個基因分別點36 μL，每孔總量5 μL；退火溫度設置為60 ℃；結果數(shù)據(jù)利用公式Ct(2-ΔΔCt)計算，從而計算出Hoxa5、BMPR1B的相對表達量。熒光定量的數(shù)據(jù)結果用SPSS 20.0軟件進行差異顯著性分析，以P<0.01作為差異極顯著性判斷標準[15-16]。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.7 Western Blotting檢測Hoxa5、BMPR1B基因蛋白質表達

首先用細胞裂解液PARI裂解提取成纖維細胞中的蛋白質，目的基因Hoxa5、BMPR1B和內(nèi)參基因β-actin分別點3個膠孔，先進行2.5 h的電泳；電泳后對蛋白質進行PVDF轉膜，用轉膜電泳槽進行2～3 h，完全轉膜后對蛋白質進行封閉2 h；封閉后用TBST進行洗膜3次；對一抗進行1∶2 000的比例稀釋，在4 ℃冰箱用一抗孵育PVDF膜12 h；一抗孵育完后進行二抗的孵育，對二抗進行1∶2 000的比例稀釋，孵育1.5 h；孵育完成后進行曝光，A液和B液按照1∶1的比例混合，避光進行壓膜，利用AIC曝光拍照。對曝光后的蛋白條帶用ImageJ 軟件進行灰度值分析，得出目的基因與內(nèi)參基因灰度值的比值[17]。

2 結果與分析

2.1 Hoxa5、BMPR1B目的基因的擴增

利用反轉錄的cDNA和上下游引物對目的基因進行PCR 擴增，以獲得Hoxa5、BMPR1B目的片段。電泳結果如圖1所示，其擴增出的片段明亮且無雜帶，Hoxa5條帶大小約為804 bp，BMPR1B條帶大小約為1 509 bp，均與已知的目的片段大小相同，可用于后期的連接試驗。

M.2000 Marker；1.BMPR1B基因擴增條帶(1 509 bp)；2.Hoxa5基因擴增條帶(804 bp)。M.2000 Marker；1.BMPR1B product(1 509 bp)；2.Hoxa5 product(804 bp).

2.2 TA克隆測序比對

將獲得的Hoxa5、BMPR1B基因片段分別與T載體連接，轉化到DH5α中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。對菌液的序列進行測序，將目的基因的序列與測序所得的序列用DNAMAN進行比對，比對結果如圖2所示，菌液中的堿基序列與已有目的序列完全一致，堿基沒有發(fā)生缺失。

Query.已知序列； Sbjct.目的基因序列。圖6同。Query.Known sequence; Sbjct.Target gene sequence.The same as Fig.6.

2.3 克隆載體的鑒定

利用試劑盒對連接好的T-Hoxa5、T-BMPR1B克隆載體進行提取，提取后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示，Hoxa5基因大小為804 bp，T載體大小為3 489 bp，連接上目的基因后應在4 293 bp處，BMPR1B基因大小為1 509 bp，T載體大小為3 489 bp，連接上目的基因后應在4 998 bp處，條帶清晰單一，結果顯示克隆載體提取成功，可用于后續(xù)的酶切試驗。

M.5000 Marker；1-2.BMPR1B克隆載體(4 998 bp)；3-4.Hoxa5克隆載體(4 293 bp)。M.5000 Marker；1-2.BMPR1B cloning vector(4 998 bp);3-4.Hoxa5 cloning vector(4 293 bp).

2.4 克隆載體、pcDNA3.1載體雙酶切

對克隆載體和pcDNA3.1載體分別進行雙酶切，克隆載體的雙酶切將目的基因片段切下，pcDNA3.1的雙酶切把載體切開，對兩者雙酶切之后的片段進行切膠回收用于后續(xù)的連接。結果如圖4所示，1-4酶切效果良好，1-2是對BMPR1B克隆載體的EcoRⅠ、NdeⅠ雙酶切，目的基因為1 509 bp，T載體為3 489 bp,與圖中條帶所吻合。3-4是對Hoxa5克隆載體的EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，目的基因為804 bp，T載體為3 489 bp,與圖中條帶所吻合。5-6是對pcDNA3.1的雙酶切，大小為5 428 bp，圖中條帶與已知大小所吻合。因此目的基因可與表達載體pcDNA3.1進行連接。

M.5000 Marker；1-2.BMPR1B克隆載體EcoR Ⅰ、NdeⅠ雙酶切；3-4.Hoxa5克隆載體EcoR Ⅰ、KpnⅠ雙酶切；5-6.pcDNA3.1載體雙酶切。

M.5000 Marker；1-2.BMPR1Bcloning vectorEcoRⅠ,NdeⅠ double digestion;3-4.Hoxa5cloning vectorEcoRⅠ,KpnⅠ double digestion;5-6.pcDNA3.1 vector double digestion.

圖4 克隆載體及pcDNA3.1載體雙酶切
Fig.4 Cloning vector and pcDNA3.1 vector double digestion

2.5 表達載體pcDNA3.1構建及鑒定

將克隆載體酶切下的BMPR1B、Hoxa5目的片段與pcDNA3.1載體進行連接，連接后進一步轉入DH5α感受態(tài)細胞中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，對所得的菌液進行普通PCR鑒定，電泳結果條帶清晰單一，大小約在804 bp處(圖5)，與已知的Hoxa5基因相符；另在1 059 bp處也有單一明亮的條帶，與已知的BMPR1B基因相符。說明BMPR1B、Hoxa5與pcDNA3.1載體連接成功。

M.2000 Marker；1-2.BMPR1B;3-4.Hoxa5。

2.6 表達載體菌液測序鑒定

獲得pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B表達載體的菌液，對菌液中質粒進行測序鑒定，與已知目的基因的序列進行比較匹配，堿基未發(fā)生缺失、添加現(xiàn)象，完全一致(圖6)。結果表明，目的基因與pcDNA3.1載體連接成功，且目的基因能夠穩(wěn)定地存在于pcDNA3.1載體中。

2.7 細胞形態(tài)觀察

2.7.1 原代培養(yǎng)形態(tài)觀察 通過組織塊法對細胞進行培養(yǎng)。24 h進行細胞的觀察，可以觀察到細胞開始慢慢貼壁，也有少數(shù)游離的組織，貼壁的細胞形狀不完全是梭形，以梭形居多，還有其他形狀的雜細胞(圖7)。培養(yǎng)96 h可見培養(yǎng)皿的底部細胞密度約為95%，此密度可對細胞進行傳代。

2.7.2 傳代培養(yǎng)形態(tài)觀察 細胞呈指數(shù)增長,細胞密度不易過大，因此需要對細胞進行傳代，否則會引起抑制生長現(xiàn)象。一般在3 d左右細胞的密度可達90%～95%，此時即可對細胞進行傳代。利用胰蛋白酶將貼壁的細胞消化成懸浮狀態(tài)，分離到其他平板中，前12 h內(nèi)細胞生長的速度會比較緩慢，12 h后生長將迅速增快，大多數(shù)細胞基本保持梭形，如圖8所示。

圖6 BMPR1B(A)、Hoxa5(B)菌液測序比對Fig.6 BMPR1B(A)，Hoxa5(B) bacterial sequencing comparison

圖7 原代培養(yǎng)24 h(×100)Fig.7 Primary culture 24 h(×100)

圖8 成纖維細胞傳代培養(yǎng)(×100)Fig.8 Fibroblasts subculture(×100)

2.8 實時熒光RT-PCR檢測Hoxa5、BMPR1B基因表達

對轉染后的細胞提取RNA并反轉錄成cDNA，應用熒光定量引物進行PCR 擴增Hoxa5、BMPR1B和GAPDH片段。電泳分析結果如圖9所示，擴增出的條帶明亮且單一，GAPDH擴增的條帶大約在128 bp處，Hoxa5擴增的條帶大約在186 bp處，BMPR1B條帶大小約在198 bp處，因此可繼續(xù)進行實時熒光定量PCR試驗。

由圖 10可知，兩目的基因Hoxa5、BMPR1B和內(nèi)參基因GAPDH的熔解曲線上均未出現(xiàn)雜亂的峰，且只有1個峰，擴增曲線比較集中統(tǒng)一，此圖表明設計的實時熒光定量PCR引物特異性良好，因而能夠獲得單一特定產(chǎn)物[15]。對共轉染的細胞和單轉染的細胞mRNA表達量進行分析，Hoxa5基因共轉染后mRNA表達量明顯升高，BMPR1B基因共轉染后mRNA表達量明顯下降，Hoxa5、BMPR1B共轉染與單轉染比較均差異極顯著(P<0.01)，見圖11。

圖10 Hoxa5、BMPR1B、GAPDH 擴增曲線圖(A)和熔解曲線峰值圖(B)Fig.10 Hoxa5,BMPR1B,GAPDH amplification (A) and melting curve(B)

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖13同。The different capital letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01).The same as Fig.13.

2.9 Hoxa5、BMPR1B基因蛋白表達的檢測

對單、共轉染的成纖維細胞進行蛋白的提取，然后進行Western Blot。將Hoxa5、BMPR1B基因共轉染與單轉染進行比較，Hoxa5共轉染的蛋白條帶明顯亮于單轉染的對照組，BMPR1B共轉染的蛋白條帶明顯暗于單轉染對照組(圖12)。利用ImageJ分析的蛋白條帶的灰度值有所不同，通過SPSS分析灰度值數(shù)據(jù)差異顯著性，得出細胞共轉染Hoxa5基因蛋白表達量極顯著高于單轉染(P<0.01)(圖13)，共轉染的BMPR1B基因蛋白表達量極顯著低于單轉染(P<0.01)。

圖12 Hoxa5、BMPR1B基因表達蛋白條帶Fig.12 Hoxa5,BMPR1B gene expression protein product

圖13 Hoxa5、BMPR1B基因蛋白相對表達量Fig.13 Hoxa5，BMPR1B gene protein relative expression

3 討論與結論

許多的信號相互傳遞著多個細胞群之間的信號反應，這些信號分子決定著毛囊的發(fā)育，它們使毛囊細胞進行著有序地增殖和分化，使之形成完整的毛囊結構[19]。毛囊形態(tài)發(fā)生是由真皮發(fā)出原始信號[20]，在毛囊基板形成的起始階段，必須先激活皮膚中Wnt信號[21-22]。有研究表明，部分上皮細胞的生長、增殖受Eda類因子和下游的轉錄因子活性的影響[23-24]。目前，調節(jié)毛囊形態(tài)發(fā)生變化的信號分子有7類，以骨形成蛋白(BMP)信號家族、Wnt通路等為主線，其他信號通路相互調和控制，在單信號通路中，也是2個及以上基因進行調節(jié)，很少出現(xiàn)單個基因的調控，相應的呈現(xiàn)抑制或促進不同的作用。BMPR1B基因屬于BMP家族，是一種促進物，對毛囊的發(fā)育起到了一定的促進作用，Hoxa5基因屬于TNF家族，是一種抑制物，對毛囊的發(fā)育起到了一定的抑制作用，現(xiàn)在對單個基因作用的研究有所存在，對2個基因以及多個基因作用的研究相對較少，通過對它們之間的相互作用來篩選良性基因，促進羊毛的生產(chǎn)。

也有學者對單個基因功能進行過鑒定，Hoxa5屬于Hox家族，得到Hoxa5對脂肪的代謝調節(jié)作用，間接控制脂肪粒細胞中的信號因子發(fā)揮作用，也有結論得出Hoxa5基因的信號調節(jié)對胚胎的發(fā)育有重要的影響，對造血干細胞的增殖調節(jié)控制起主導作用。Hoxa5對毛囊的發(fā)育也有相應的鑒定，是否影響其他與毛囊發(fā)育相關的基因，本試驗利用BMPR1B基因和它進行相互作用的研究，BMPR1B本身對毛囊的發(fā)育有一定的促進作用，Hoxa5的存在以及過表達是否會有利于BMPR1B基因的表達。通過試驗結果分析兩者的相互作用關系，Hoxa5基因的過表達對BMPR1B基因起到了一定的抑制作用，使得促進羊毛發(fā)育的基因受到了抑制，因此兩者同時的過表達不利于羊毛的生長，以后的羊毛生產(chǎn)過程中盡量避開抑制性基因的過表達。

Hoxa5、BMPR1B單個基因功能的鑒定出現(xiàn)過，但與毛囊發(fā)育功能的鑒定較少。Hoxa5、BMPR1B基因兩者之間相互作用關系的研究未曾出現(xiàn)過，本研究可以從mRNA水平和蛋白水平上來鑒定兩者之間的作用關系。本研究通過表達載體的構建成功的構建了pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B基因表達載體，轉染到敖漢細毛羊的成纖維細胞中，觀察細胞的形態(tài)以及測定相應表達指標，從而進一步研究基因的作用以及兩者之間的相互作用關系。轉染后的細胞，Hoxa5、BMPR1B基因的mRNA和蛋白表達量均有明顯的升高，初步驗證了通過載體構建后基因過表達。單方面研究Hoxa5基因，得知Hoxa5基因能夠抑制毛囊的發(fā)育，作為和其他基因之間是否存在促進或拮抗作用有待研究，本試驗通過與BMPR1B基因的共同研究得出Hoxa5基因自身過表達的同時也將會影響其他信號通路中的基因，至于是促進還是拮抗則根據(jù)它們的表達量來判斷[18]。

本研究分別對Hoxa5、BMPR1B基因表達載體進行構建，轉染成纖維細胞，利用實時熒光定量PCR、Western Blot等檢測mRNA和蛋白的表達，結果成功地構建了pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B，并且共轉染成纖維細胞Hoxa5基因的表達量明顯升高，BMPR1B的mRNA表達量和蛋白表達量均明顯下降，且共轉染組的表達量極顯著低于單轉染組(P<0.01)，因而推測Hoxa5基因抑制了BMPR1B基因的表達，BMPR1B基因促進了Hoxa5基因的表達，為進一步在個體水平上研究其功能奠定基礎。