孫玉 張洪海 陳德喜 魏飛力 郭向華 石英

[摘要] 目的 研究乙肝表面抗原（HBsAg）+/乙肝表面抗體（HBsAb）+慢性乙型肝炎（CHB）患者S區(qū)基因突變情況。 方法 選取2012年6月～2017年10月首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院（以下簡稱“我院”）HBsAg和HBsAb雙陽性的CHB患者32例為研究對象（HBsAg+/HBsAb+組），隨機選取在同一時期我院診斷為HBsAg+和HBsAb-的CHB患者79例作為對照（HBsAg+/HBsAb-組）。分離其血漿病毒DNA，PCR擴增S區(qū)基因，測序分析其突變情況。 結(jié)果 HBsAg+/HBsAb+組患者全部存在S區(qū)突變（100%），其頻率顯著高于HBsAg+/HBsAb-組（84.81%）（P < 0.05），而且突變多集中在S區(qū)亞單位1和3區(qū)域;HBsAg+/HBsAb+組S區(qū)多重位點突變的比例顯著高于HBsAg+/HBsAb-組（P < 0.01）。 結(jié)論 S區(qū)基因突變頻率的增加以及多重突變的存在與CHB患者S抗原抗體的變化密切相關，而這一突變的累積預示著不良的疾病進程。

[關鍵詞] 慢性乙型肝炎;乙肝表面抗原;乙肝表面抗體;S基因;突變

[中圖分類號] R575.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（b）-0118-04

[Abstract] Objective To study the S region gene mutation in patients with hepatitis B surface antigen （HBsAg） +/ hepatitis B surface antibody （HBsAb） + chronic hepatitis B （CHB）. Methods From June 2012 to October 2017， 32 cases of CHB patients with double positive HBsAg and HBsAb in Beijing You′an Hospital， Capital Medical University （hereinafter referred to as “our hospital”） were selected as subjects （HBsAg+/HBsAb+ group），79 cases of CHB patients diagnosed with HBsAg+ and HBsAb- in our hospital in the same period were randomly selected as the control group （HBsAg+/HBsAb- group）. The plasma viral DNA was isolated， the S region gene was amplified by PCR， and the mutation was analyzed by sequencing. Results All patients in the HBsAg+/HBsAb+ group had S-region mutation （100%）， and the frequency was significantly higher than that in the HBsAg+/HBsAb- group （84.81%） （P < 0.05）. Moreover， the mutations were mostly concentrated in the subunits 1 and 3 of S region. The proportion of multiple site mutations in S region in HBsAg+/HBsAb+ group was significantly higher than that in HBsAg+/HBsAb- group （P < 0.01）. Conclusion The increased frequency of S region gene mutation and the presence of multiple mutations are closely related to the change of S antigen antibody in CHB patients， and the accumulation of this mutation indicates an adverse disease process.

[Key words] Chronic hepatitis B; HBV surface antigen; HBV surface antibody; S gene; Mutation

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）呈全世界流行，根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2017年全球肝炎報告》顯示，全球約有3.25億人染有慢性乙肝病毒或丙肝病毒，其中2.57億人感染有乙肝病毒[1]，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝硬化和肝癌[2]。我國是乙型肝炎大國，據(jù)推算，我國目前仍有HBsAg陽性者約7000萬，乙型肝炎患者2000萬～3000萬，肝硬化患者約100萬，原發(fā)性肝癌患者約30萬[3]。

在病毒感染過程中，抗體介導的免疫反應對于清除HBV病毒顆粒，清除感染病毒的肝細胞起重要的作用。HBsAg在血清中出現(xiàn)，是乙肝病毒感染的標志，而HBs抗體的出現(xiàn)被認為是血清學治愈的標志[4]。然而有報道稱臨床上有10%～25%的慢性乙肝患者同時存在HBsAg和HBsAb[5-6]陽性，出現(xiàn)這一現(xiàn)象有宿主免疫因素和病毒因素兩個方面，其原因尚不清楚[7-9]。病毒方面可能的機制是病毒發(fā)生了選擇性的免疫逃逸突變[10]。本研究選取了32例HBsAg和HBsAb雙陽性的慢性乙型肝炎（CHB）患者，另選取HBsAg+和HBsAb-的CHB患者79例作為對照，分析其S區(qū)突變特點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年6月～2017年10月首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院（以下簡稱“我院”）HBsAg和HBsAb雙陽性的CHB患者32例，診斷標準參照《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年版）[11]。HBsAg+/HBsAb+組具體入組標準：①所有患者間隔至少6個月，連續(xù)2次檢查確定HBsAg與HBsAb同時陽性;②所有患者抗-HAV、HCV、HDV、HEV、HIV抗體均為陰性，且不合并藥物性肝損害、自身免疫性肝病、酒精性肝病病史;③所有患者腹部超聲、腹部強化CT、腹部強化MRI等影像學檢查或肝組織病理學檢查均未提示肝硬化及原發(fā)性肝癌。隨機選取同一時期我院診斷為HBsAg+和HBsAb-的慢性乙型肝炎患者79例作為對照（HBsAg+/HBsAb-組）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，均經(jīng)患者知情同意。

1.2 血清免疫學指標的檢測和HBV DNA定量檢測

采集所有受檢者清晨空腹外周靜脈血5 mL，收集上層血清（所有結(jié)果均經(jīng)過復檢），標本放置于-80℃冰箱保存。HBsAg和HBsAb應用羅氏公司Elecsys HBsAg/HBsAb Ⅱ定量試劑檢測，所用設備為羅氏公司Cobas定量檢測儀。血清HBV DNA定量檢測應用美國通用公司7500實時定量PCR檢測系統(tǒng)進行檢測。其他臨床檢測指標由我院檢驗科完成。

1.3 S區(qū)突變檢測

應用全血DNA分離試劑盒（DNeasy Blood and Tissue Kit，Qiagen，Germany）從200 μL全血中提取基因組DNA，按照試劑盒操作手冊進行操作。利用巢式PCR擴增HBV S區(qū)，PCR引物如下：外側(cè)引物HBVS1F（5′-TTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3′），HBS1R（5′-TG-CTAGGAGTTCCGCAGTATG-3′），內(nèi)側(cè)引物HBS2F（5′-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-3′），HBVS2R（5′-GCAA-AGCCCAAAAGACCCAC-3′）。PCR反應體系：50 μL PCR反應體系中加入5 μL 10×擴增緩沖液，dNTP（2.5 mmol/L）5 μL，引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，加水至總體積50 μL。PCR條件如下：94℃預變性2 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共33個循環(huán)。第二輪PCR反應體系、條件相同。PCR產(chǎn)物直接送公司進行測序，測序由北京博邁德公司完成。為了進一步分析S區(qū)突變，參考既往文獻[8]，將S區(qū)的主要功能單位MHR（主蛋白抗原主要親水區(qū)）區(qū)分為4個亞單位，即亞單位1（Subregion 1，氨基酸殘基100～120），亞單位2（Subregion 2，氨基酸殘基121～123），亞單位3（Subregion 3，氨基酸殘基124～137），亞單位4（Subregion 4，氨基酸殘基138～147），亞單位5 （Subregion 5，氨基酸殘基148～169），而“a”決定區(qū)為氨基酸殘基124～147區(qū)間。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組獨立樣本均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗或t′檢驗，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CHB患者臨床資料比較

兩組在年齡、性別、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、HBsAg水平方面，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。兩組患者HBeAg和HBeAb的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。HBsAg+/HBsAb+組HBV DNA、HBsAb水平顯著高于HBsAg+/HBsAb-組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 兩組CHB患者主要位點突變頻率分析

HBsAg+/HBsAb+組患者均存在S區(qū)的突變，總突變率為100%，HBsAg+/HBsAb-組有67例患者存在S區(qū)突變，總突變率為84.81%（67/79），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。將兩組患者所有突變氨基酸位點的突變頻率進行比較，結(jié)果顯示HBsAg+/HBsAb+組患者氨基酸位點突變集中于Y100～R160等11個氨基酸位點，而HBsAg+/HBsAb-組患者氨基酸位點突變相對比較分散，分布于整個S區(qū)（圖1）。將HBsAg+/HBsAb+組患者的11個氨基酸突變位點與HBsAg+/HBsAb-組進行比較，結(jié)果顯示，HBsAg+/HBsAb+組患者Q101、I126位點的突變頻率均高于HBsAg+/HBsAb-組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 兩組患者MHR主要功能區(qū)突變分布及百分比比較

將S區(qū)的主要功能單位MHR進一步區(qū)分為4個亞單位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于HBsAg+/HBsAb-組，HBsAg+/HBsAb+組患者，其突變主要集中在亞單位1和3區(qū)，兩組比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。HBsAg+/HBsAb+組患者“a”決定區(qū)突變頻率高于HBsAg+/HBsAb-組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表3。

HBsAg+/HBsAb+組患者中，93.75%（30/32）的患者存在2個以上突變位點的多重突變，HBsAg+/HBsAb-組僅有41.77%（33/79）的患者具有2個以上的多重突變，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。HBsAg+/HBsAb+組中有2例患者僅存在單位點S區(qū)氨基酸突變，而HBsAg+/HBsAb-組中有34例患者僅存在單位點S區(qū)氨基酸突變，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），且HBsAg+/HBsAb-組中有12例患者不存在S區(qū)突變。見圖2。

HBsAg：乙型肝炎病毒表面抗原;HBsAb：乙型肝炎病毒表面抗體;CHB：慢性乙型肝炎

3 討論

HBV S基因的突變能夠幫助病毒逃避中和抗體和疫苗的保護[12]，而S基因的變異亦對疾病的進展產(chǎn)生不利的影響，與HBV相關的多數(shù)中晚期的肝臟疾病有關[13]。HBsAg+/HBsAb+患者是一組比較特殊的人群，深入研究其分子機制，對于全面認識慢性乙型肝炎的自然史，了解其免疫應答狀態(tài)等都具有深遠的意義。

本研究選取了32例HBsAg+/HBsAb+CHB患者，進行S區(qū)基因的測序，為了避免基因型對于病毒序列的影響，該32例患者經(jīng)檢測分析均為C1型HBV感染。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的32例患者均存在S區(qū)基因突變，這些患者一般臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學意義，但血漿HBV DNA水平則高于HBsAg+/HBsAb-組，這也進一步預示著該組患者擁有著不良的預后。在32例患者中，其中2例患者曾經(jīng)接受過HBV亞單位疫苗的注射。而這兩名患者的HBsAb抗體滴度均相對較低，分別為14.35 U/L和43.27 U/L。結(jié)果提示，HBV疫苗的注射對于HBV感染的意義及其具體機制有待于更為深入的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)HBsAg+/HBsAb+組患者總體突變率顯著高于HBsAg+/HBsAb-組。與以往報道[14-15]不同的是，諸多被發(fā)現(xiàn)與免疫逃逸有關的重要點突變，在本研究的兩組人群中比較差異并無統(tǒng)計學意義，本研究發(fā)現(xiàn)Q101、I126位點的突變頻率在兩組之間比較差異有統(tǒng)計學意義，提示出現(xiàn)這幾個位點的突變可能與患者血清中出現(xiàn)S抗原和抗體雙陽性有關。而歐美研究較多的G145R突變在本群體中突變率較低[16]，這可能與歐美HBV亞型主要為A2亞型，而本研究中所有患者均為C亞型相關[17]。在進一步對S區(qū)進行分區(qū)的研究中發(fā)現(xiàn)，HBsAg+/HBsAb+組S區(qū)不同功能單位的突變情況與HBsAg+/HBsAb-組亦具有顯著的差別，因此，除了單獨研究幾個重要位點的突變以外，對于眾多突變位點突變之間的聯(lián)系亦不容忽視。本研究還發(fā)現(xiàn)，HBsAg+/HBsAb+患者均存在著多重位點的同時突變，這也進一步說明了，積累的多位點突變對于病毒的致病以及機體免疫功能的調(diào)節(jié)具有重要意義[18-19]。

HBsAg+/HBsAb+CHB患者十分少見，但究竟抗原抗體同時存在的狀態(tài)對于疾病的恢復是有利還是有弊，至今還存在爭議。如能收集更多的臨床資料，對于這類患者進行跟蹤隨訪，密切關注其免疫指標及病毒學指標變化的趨勢，將大大有利于這方面機制的研究。

[參考文獻]

[1]? Hutin YJ，Bulterys M，Hirnschall GO. How far are we from viral hepatitis elimination service coverage targets？ [J] J Int AIDS Soc，2018，21（Suppl 2）：e25050.

[2]? Ott JJ，Stevens GA，Groeger J，et al. Global epidemiology of hepatitis B virus infection：new estimates of age-specific HBsAg seroprevalence and endemicity [J]. Vaccine，2012，30（12）：2212-2219.

[3]? 賈繼東，莊輝.攜手推動中國慢性乙型肝炎治療的可及性[J].肝臟，2016，21（4）：239-240.

[4]? Gerlich WH. Medical virology of hepatitis B：how it began and where we are now [J]. Virol J，2013，10：239.

[5]? Kohno H，Inoue T，Tsuda F，et al. Mutations in the envelope gene of hepatitis B virus variants co-occurring with antibody to surface antigen in sera from patients with chronic hepatitis B [J]. J Gen Virol，1996，77（Pt 8）：1825-1831.

[6]? Mimms L. Hepatitis B virus escape mutants：“pushing the envelope”of chronic hepatitis B virus infection [J]. Hepatology，1995，21（3）：884-887.

[7]? Ding F，Miao XL，Li YX，et al. Mutations in the S gene and in the overlapping reverse transcriptase region in chronic hepatitis B Chinese patients with coexistence of HBsAg and anti-HBs [J]. Braz J Infect Dis，2016，20（1）：1-7.

[8]? Lee BS，Cho YK，Jeong SH，et al. Korean Hepatitis Epidemiology Study Group. Nationwide seroepidemiology of hepatitis B virus infection in South Korea in 2009 emphasizes the coexistence of HBsAg? and anti-HBs [J]. J Med Virol，2013，85（8）：1327-1333.

[9]? Liu K，Xie M，Lu X，et al. Mutations within the major hydrophilic region （MHR） of Hepatitis B virus from individuals with simultaneous HBsAg and anti-HBs in Guangzhou，Southern China [J]. J Med Virol. 2018，90（8）：1337-1342.

[10]? Inoue J，Kondo Y，Wakui Y，et al. Reactivation of resolved hepatitis B virus infection with immune escape mutations after long-term corticosteroid therapy [J]. Clin J Gastroenterol，2016，9（2）：93-98.

[11]? 中華醫(yī)學會肝病分會.中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南[J].臨床肝膽病雜志，2011，27（1）：1-16.

[12]? Cooreman MP，Leroux-Roels G，Paulij WP. Vaccine-and hepatitis B immune globulin-induced escape mutations of hepatitis B virus surface antigen [J]. J Biomed Sci，2001，8（3）：237-247.

[13]? Shizuma T，Hasegawa K，Ishikawa K，et al. Molecular analysis of antigenicity and immunogenicity of a vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus [J]. J Gastroenterol，2003，38（3）：244-253.

[14]? Rodriguez-Frias F，Buti M，Jardi R，et al. Genetic alterations in the S gene of hepatitis B virus in patients with acute hepatitis B，chronic hepatitis B and hepatitis B liver cirrhosis before and after liver transplantation [J]. Liver，1999，19（3）：177-182.

[15]? Mohebbi A，Lorestani N，Tahamtan A，et al. An Overview of Hepatitis B Virus Surface Antigen Secretion Inhibitors [J]. Front Microbiol，2018，9：662.

[16]? Kalinina T1，Iwanski A，Will H，et al. Deficiency in virion secretion and decreased stability of the hepatitis B virus immune escape mutant G145R [J]. Hepatology，2003， 38（5）：1274-1281.

[17]? Liu Y，Zhang L，Zhou JY，et al. Clinical and Virological Characteristics of Chronic Hepatitis B Patients with Coexistence of HBsAg and Anti-HBs [J]. PLoS One，2016， 11（1）：e0146980.

[18]? Wang L，Liu H，Ning X，et al. Sequence analysis of the S gene region in HBV DNA from patients positive for both HBsAg and HBsAb tests [J]. Hepatol Res，2010，40（12）：1212-1218.

[19]? Ding F，Yu HG，Li YX，et al. Sequence analysis of the HBV S protein in Chinese patients with coexisting HBsAg and anti-HBs antibodies [J]. J Med Virol，2015，87（12）：2067-2073.

（收稿日期：2018-06-08? 本文編輯：封? ?華）