聶昌平，吳丹，楊俊，萬路平，梁光平，*

（1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州遵義563006；2.遵義市第五人民醫(yī)院，貴州遵義563000）

獼猴桃根來源于獼猴桃科植物獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）的根或根皮，主要分布于我國陜西、江西、湖南、湖北、福建、浙江、河南、安徽等省，具有活血消腫、祛風(fēng)利濕、清熱利尿、散熱止血的功效[1]。獼猴桃根成分類型主要有三萜、黃酮、甾體、蒽醌、酚酸、木質(zhì)素、揮發(fā)油、糖類、鞣質(zhì)、香豆素、生物堿、脂肪等[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，獼猴桃根具有抗腫瘤[3-5]、抗氧化[6]、抗血栓[7]、增強(qiáng)免疫力[8-9]以及抗病毒[10-11]作用。前期研究還發(fā)現(xiàn)[12]，獼猴桃根乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。而α-葡萄糖苷酶在人類的糖原降解和動(dòng)物、植物、微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能[13]。同時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制劑也是作為治療糖尿病的首選藥物，被視為最具臨床治療應(yīng)用價(jià)值的降血糖藥物[14]。為進(jìn)一步挖掘獼猴桃根在防治糖尿病方面的價(jià)值，本研究對獼猴桃根石油醚提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行研究，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析檢測獼猴桃根石油醚提取物的組成成分，為獼猴桃根的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃根：貴州省遵義市新蒲新區(qū)蝦子鎮(zhèn)，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校張學(xué)愈副教授鑒定為獼猴桃科植物中華獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）的根或根皮，樣本存放于遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系。

α-葡萄糖苷酶（500 000 U/g）：日本OSAKA BIO 公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）：Sigma 公 司 ； 阿 卡 波 糖（acarbose）：德國拜耳公司；石油醚（60 ℃～90 ℃）、三氟化硼、氫氧化鈉、甲醇、正庚烷、二氯甲烷、二甲基亞砜、磷酸鉀、碳酸鈉、氯化鈉：阿拉丁試劑公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HP6890/5975C 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；Max-190 型酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；N-1100V-W/WD 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會社；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國Cambridge MA 公司；DZF-1 型真空干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；D7031EASYpure II 超純水機(jī)：巴恩斯特德國際有限公司；SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱：浙江力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的提取

取獼猴桃根粗粉150 g 于圓底燒瓶，加入300 mL石油醚（60 ℃～90 ℃），加熱回流提取3.0 h，靜置冷卻，過濾，減壓濃縮，干燥得22.3 g 提取物。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶活性檢測

設(shè)置1、2、20、50、100 μg/mL 5 個(gè)濃度。反應(yīng)體系[9]：80 μL 磷酸鉀緩沖液（pH 6.9）中依次加入10 μL α-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL），指定濃度的樣品溶液10 μL，37 ℃恒溫反應(yīng)10 min，加入20 μL PNPG（2.5 mmol/L），37 ℃繼續(xù)恒溫15 min，加入40 μL Na2CO3溶液（1 mol/L）終止反應(yīng)，于405 nm 波長下測定吸光度（A）。阿卡波糖為陽性對照，同時(shí)設(shè)定空白對照（只加緩沖液）和陰性對照（只加緩沖液和酶液）。酶活性抑制率按下式計(jì)算：

1.3.3 提取物供試液的制備

1.3.3.1 非甲酯化樣品

取獼猴桃根石油醚提取物18 mg，加入5 mL 二氯甲烷溶解，微孔濾膜過濾，濾液備用。

1.3.3.2 甲酯化樣品

稱取提取物22 mg，放入密閉瓶中，加入2 mL 氫氧化鈉甲醇溶液（2%），80 ℃恒溫反應(yīng)0.5 h，加入1.75 mL三氟化硼甲醇溶液（15%），繼續(xù)恒溫反應(yīng)2 min。停止加熱，取出密閉瓶，加水少量，迅速冷卻至室溫。準(zhǔn)確加入2 mL 正庚烷，振搖2 min，再加入氯化鈉至飽和，靜置分層，取上層溶液到進(jìn)樣瓶，備用。

1.3.4 非甲酯化樣品的氣相色譜條件

色譜柱為FB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，初始溫度58 ℃（保留2 min），以6 ℃/min升溫至310 ℃，保持10 min，運(yùn)行時(shí)間54 min，氣化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999 %），柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，分流比20∶1，溶劑延遲時(shí)間4.0 min。

1.3.5 甲酯化樣品的氣相色譜條件

色譜柱為FB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，初始溫度120 ℃（保留2 min），以4 ℃/min 升溫至220 ℃，保持12 min，再以10 ℃/min 升溫至310 ℃，保持6 min，運(yùn)行時(shí)間54 min；氣化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0mL/min，分流比20∶1，溶劑延遲時(shí)間7.0min。

1.3.6 質(zhì)譜條件

離子源為EI 源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 518 V（甲酯化樣品為1 659 V）；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29 amu～500 amu。

1.3.7 定性定量分析

總離子流圖中的各峰與Wiley275 和Nist2014 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行對照鑒定，用氣相色譜峰面積歸一化法測定各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-葡萄糖苷酶活性

提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性見表1。

表1 獼猴桃根石油醚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性（x±s，n=6）Table 1 Inhibitory effect on α-glucosidase of petroleum ether extracts from Actinidia chinensis radix（x±s，n=6）

由表1可知，提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率與濃度呈正相關(guān)，具有濃度依賴性，在50、100 μg/mL 濃度下可抑制作用能顯著地抑制α-葡萄糖苷酶的活性。在最大考察濃度時(shí)，提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率可達(dá)（89.38±1.27）%，優(yōu)于相同濃度下阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率（49.57±2.28）%。

2.2 GC-MS結(jié)果及分析

2.2.1 非甲酯化樣品

非甲酯化樣品的總離子流圖見圖1。

圖1 非甲酯化樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion flow chart of components in non-methyl esterification sample

對總離子流圖中的信號峰進(jìn)行系統(tǒng)檢索及Nist2005 和Wiley275 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖核對，共檢測出37種成分，鑒定出29 種，占流出峰總面積的93.55%，其中包括12 個(gè)酯類（77.11%）、12 個(gè)醛酮類（11.18 %）、3 個(gè)醇類（4.83%）、2 個(gè)呋喃（0.43%），各組分的鑒定結(jié)果見表2。

由表2可知，獼猴桃根石油醚提取物主要成分為（按相對含量多少排序）酯類：油酸乙酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸甲酯、硬酯酸乙酯、亞油酸甲酯，相對含量分別為37.30%、14.69%、9.50%、5.32%、4.70%、2.48 %。醛酮類：（E）-2-癸烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、（E）-2-庚烯醛、（E，Z）-2，4-癸二烯醛、（E）-2-十一烯醛、（E，E）-2，4-壬二烯醛，相對含量分別為3.46%、2.24%、1.52%、1.22%、0.85%、0.60%。醇類僅松柏醇相對含量較高，為4.21 %，其余化合物含量較低。

2.2.2 甲酯化樣品結(jié)果分析

甲酯化樣品的總離子流圖見圖2。

表2 獼猴桃根石油醚提取物揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 2 GC-MS analysis of volatile oils of petroleum ether extracts from Actinidia chinensis radix

檢出的24 種成分與Nist2005、Wiley275 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫對比檢索后，從中鑒定了20 種，油酸甲酯（46.01 %）、亞油酸甲酯（31.81 %）、棕櫚酸甲酯（13.22 %）和硬酯酸甲酯（5.45%）4 種脂肪酸的相對含量較高，占檢出所有成分的96.48%，各組分的鑒定結(jié)果如表3所示。

圖2 甲酯化樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion flow chart of components in methyl esterification sample

表3 獼猴桃根石油醚提取物甲酯化樣品的GC-MS 分析結(jié)果Table 3 Analysis of components in methyl esterification sample

2.2.3 甲酯化與非甲酯化樣品成分對比

對比表2和表3可知，油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬酯酸甲酯、辛酸甲酯為共有成分，但它們在甲酯化和非甲酯化樣品中的相對含量存在差異，以油酸甲酯的差異最大，亞油酸甲酯次之。油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬酯酸甲酯、辛酸甲酯在獼猴桃根石油醚提取物中是否同時(shí)以酯類和羧酸形式存在，有待通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照進(jìn)行核實(shí)。

3 結(jié)論與討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑是治療糖尿病的首選藥物，與胰島素及其他口服降糖藥相比，α-葡萄糖苷酶抑制劑能有效阻止糖尿病患者餐后血糖迅速升高，使血糖維持在一定水平，減少血糖對胰腺的刺激，從而有效預(yù)防并改善糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[12]。在前期研究的基礎(chǔ)上，對獼猴桃根石油醚提取物的α-葡萄糖苷酶抑制作用及化學(xué)組成深入分析。結(jié)果表明，獼猴桃根石油醚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有濃度依賴性，在最大考察濃度時(shí)，提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率可達(dá)（89.38±1.27）%。采用GC-MS 對獼猴桃根石油醚提取物的組成進(jìn)行了分析，從非甲酯化樣品中鑒定出29 種成分，從甲酯化樣品中鑒定出20 種成分。其中，油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬酯酸甲酯、辛酸甲酯在甲酯化和非甲酯樣品中都被鑒定出。這5 種成分在獼猴桃根石油醚提取物中是否同時(shí)以酯類和羧酸形式存在，有待通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照進(jìn)行核實(shí)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，亞油酸及其酯類具有降血糖作用[15-16]，而降血糖作用與抑制α-葡萄糖苷酶的活性有關(guān)。結(jié)合本研究GC-MS 對獼猴桃根石油醚提取物的成分分析結(jié)果，推測獼猴桃根石油醚提取物具有降血糖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是亞油酸、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯等成分。