蔣華梅，王向前

（1.貴陽(yáng)學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550005；2.貴陽(yáng)學(xué)院圖書館，貴州貴陽(yáng)550005）

插田泡是薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）植物，果實(shí)6月～8月成熟，富含VC、蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶、花色苷等成分，營(yíng)養(yǎng)十分豐富[1-2]?；ㄉ諏冱S酮多酚類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)血脂及預(yù)防心肌缺損等生物活性和多種保鍵功能[3-5]，還可作為食用色素和功能食品原料使用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)懸鉤子屬類植物，如黑莓、樹(shù)莓、紅樹(shù)莓果實(shí)中花色苷的提取純化及鑒定、抗氧化活性、抑菌、抗腫瘤方面進(jìn)行了大量的研究[6-19]。懸鉤子屬植物插田泡（Rubus coreanusMaq.）果實(shí)花色苷的研究?jī)H涉及酸化乙醇溶劑振蕩提取及粗提物抗氧化活性方面的報(bào)道[1]。關(guān)于插田泡果實(shí)花色苷提取方法及工藝的優(yōu)化研究還不夠系統(tǒng)和全面。

植物花色苷的提取方法有溶劑法、微波輔助法、超聲波輔助法、酶法、超臨界流體萃取法[3，19-21]等。溶劑浸提法，設(shè)備簡(jiǎn)單、投資少、耗時(shí)費(fèi)事。超聲輔助提取法是利用超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)來(lái)加速物質(zhì)的擴(kuò)散溶解，有效地提高化合物提取的得率和含量，具有成本低、提取效率高、提取量大、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM），是一種優(yōu)化工藝參數(shù)的有效方法，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量及因素交互影響的問(wèn)題。因此，本試驗(yàn)采用超聲輔助提取技術(shù)對(duì)貴州野生插田泡果實(shí)花色苷進(jìn)行提取，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲提取工藝，以期為插田泡果實(shí)花色苷資源的全面高效利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生插田泡果實(shí)2018 年6 月采自貴州省安順市西秀區(qū)，挑選完全成熟的紫黑色果實(shí)去離子水洗凈后置于-40 ℃冰箱內(nèi)冷凍儲(chǔ)存，試驗(yàn)前室溫、避光條件下解凍。無(wú)水乙醇、醋酸鈉、氫氧化鈉、氯化鉀（均為分析純）：重慶川東化工集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104 電子天平：上海舜禹恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C 精密酸度計(jì)：上海雷磁·創(chuàng)益儀器儀表有限公司；KQ-300DE 數(shù)顯溫超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；BluStar-A 掃描型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵：北京市泰和格潤(rùn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.0 g 插田泡成熟果實(shí)于研缽中研磨5 min，多次少量加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液（pH3）（共用30 mL）洗滌研缽，溶液及果實(shí)均轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，超聲振蕩提取20 min，抽濾，濾液于200 nm～600 nm 范圍內(nèi)掃描，以確定插田泡果實(shí)花色苷的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.2 花色苷含量的檢測(cè)

1.3.2.1 超聲輔助提取流程

稱取室溫解凍果實(shí)1 g→研磨5 min→加入75%乙醇溶液→超聲輔助提取→抽濾→收集濾液→定容至100 mL→花色苷粗提液

1.3.2.2 花色苷含量的測(cè)定及計(jì)算

準(zhǔn)確移取氯化鉀緩沖液（pH1.0）3 mL 與1 mL 插田泡果實(shí)花色苷粗提液混合，搖勻；另準(zhǔn)確移取醋酸鈉緩沖溶液（pH4.5）3 mL 與1 mL 插田泡果實(shí)花色苷粗提液與混合，搖勻。空白對(duì)照為各對(duì)應(yīng)的緩沖溶液，于插田泡果實(shí)花色苷最大吸收波長(zhǎng)538 nm 處測(cè)吸光度，按照以下公式（1）計(jì)算花色苷含量[1]：

式中：X為插田泡果實(shí)花色苷得率，mg/100 g；ΔT為ApH1和ApH4.5的吸光度差值；V為插田泡果實(shí)花色苷提取液的總體積，mL；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449 g/mol；ε 為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，29 600 L/（mol·cm）；m為樣品質(zhì)量，g；b為比色皿厚度，1 cm。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

按1.3.2節(jié)方法，提取插田泡果實(shí)花色苷，提取條件為：固定反應(yīng)條件為溶劑75 %乙醇（pH3）、料液比1 ∶20（g/mL）、溫度50 ℃、提取時(shí)間30 min，考察不同超聲功率（120、150、180、210、240 W）對(duì)花色苷得率的影響；固定反應(yīng)條件為超聲功率150 W、溶劑75%乙醇（pH3）、料液比1 ∶20（g/mL）、溫度50 ℃，考察不同超聲提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對(duì)花色苷得率的影響；固定反應(yīng)條件為超聲功率150 W、溶劑75 %乙醇（pH3）、料液比1 ∶20（g/mL）、提取時(shí)間30 min，考察不同提取溫度（水溫16、20、30、40、50 ℃）對(duì)花色苷得率的影響；固定反應(yīng)條件為超聲功率150 W、料液比1 ∶20（g/mL）、溫度50 ℃、提取時(shí)間30 min，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（55%、65%、75%、85%、95%）（pH3）對(duì)花色苷得率的影響；固定反應(yīng)條件為溶劑75%乙醇（pH3）、超聲功率150 W、溫度50 ℃、提取時(shí)間30 min，考察不同料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL）]對(duì)花色苷得率的影響；固定反應(yīng)條件為溶劑75%乙醇、超聲功率150 W、溫度50 ℃、料液比1 ∶20（g/mL），考察不同乙醇pH 值（1、2、3、4、5）對(duì)花色苷得率的影響。進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素變量對(duì)插田泡果實(shí)花色苷得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲功率（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、料液比（D）4 個(gè)因素，利用Design-Expert 8.6 軟件，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，響應(yīng)值為插田泡果實(shí)花色苷得率（Y），進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定插田泡果實(shí)花色苷的最佳超聲提取條件，因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

插田泡花色苷紫外-可見(jiàn)光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 插田泡花色苷紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.1 UV-visible spectrum of Rubus coreanus Maq.anthocyanin

文獻(xiàn)報(bào)道，花色苷類物質(zhì)的紫外及可見(jiàn)分光光譜圖中有兩個(gè)特征吸收峰：一個(gè)在270 nm～290 nm 附近，與苯甲酰基有關(guān)；另一個(gè)在500 nm～540 nm，與肉桂?；嘘P(guān)[4，22]。如圖1所示，插田泡果實(shí)花色苷在292 nm和538 nm 波長(zhǎng)處有兩個(gè)特征吸收峰。因此，插田泡果實(shí)花色苷乙醇溶液中的最大吸收波長(zhǎng)為538 nm，作為本試驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲功率對(duì)花色苷得率的影響

超聲功率對(duì)花色苷得率的影響見(jiàn)圖2。

如圖2所示，插田泡果實(shí)花色苷的得率隨著超聲功率的升高先呈上升趨勢(shì)。超聲功率的升高使花色苷更易溶出，花色苷得率升高。功率為150 W 時(shí)，花色苷得率最大，隨后得率呈下降趨勢(shì)。原因是超聲功率的增大加快了插田泡果實(shí)外皮細(xì)胞壁破裂速度[11]，花色苷加速溶出，但功率過(guò)高，造成溶液體系溫度太高，插田泡花色苷的糖苷分離[23]，從而導(dǎo)致花色苷分解，得率下降。所以，選擇超聲功率120、150、180 W 3 個(gè)水平條件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.2 超聲提取時(shí)間對(duì)花色苷得率的影響

超聲提取時(shí)間對(duì)花色苷得率的影響見(jiàn)圖3。

圖2 超聲功率對(duì)花色苷得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on anthocyanins yield

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)花色苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on anthocyanins yield

如圖3所示，插田泡果實(shí)花色苷得率隨超聲提取時(shí)間先快速增大，隨后緩慢下降。說(shuō)明超聲提取30 min時(shí)，插田泡樣品與乙醇溶劑充分接觸，達(dá)到傳質(zhì)飽和，此時(shí)插田泡果實(shí)花色苷已經(jīng)充分溶出，得率最高；繼續(xù)增加超聲提取時(shí)間，會(huì)破壞花色苷分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致部分花色苷分解[11，24]，降低得率。所以，選擇超聲提取時(shí)間20、30、40 min 3 個(gè)水平條件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.3 超聲提取溫度對(duì)花色苷得率的影響

提取溫度對(duì)花色苷得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)花色苷得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on anthocyanins yield

如圖4所示，在不加熱的情況下，溶液室溫16 ℃超聲提取時(shí)，插田泡花色苷的得率最高。其后隨著超聲提取溫度的升高，會(huì)導(dǎo)致插田泡果實(shí)花色苷得率下降。40 ℃前花色苷得率下降較緩慢，40 ℃后花色苷得率下降較為顯著。這是由于插田泡花色苷對(duì)熱十分敏感，超聲提取溶液溫度高于16 ℃即會(huì)破壞插田泡花色苷結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[11]，造成花色苷的降解。因此，本試驗(yàn)超聲提取時(shí)不加熱，溶液室溫即為最佳提取條件。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)（pH3）對(duì)花色苷得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on anthocyanins yield

如圖5所示，插田泡果實(shí)花色苷的得率先隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)75%時(shí)，花色苷得率減少。這是由于溶液中適當(dāng)增加乙醇等有機(jī)溶劑能促使植物花色苷中氫鍵斷裂，小分子的花青素溶出，使溶液中的色素含量提高；但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)75%，溶液的極性降低，偏離了插田泡花色苷的極性，親水性花色苷的析出減少，導(dǎo)致總花色苷得率降低[25-27]。所以，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、75%、85%3 個(gè)水平條件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.5 料液比對(duì)花色苷得率的影響

料液比對(duì)花色苷得率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 料液比對(duì)花色苷得率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on anthocyanins yield

如圖6所示，隨著料液比液體量增大，插田泡果實(shí)花色苷得率先逐漸增大后減小?？赡茉蚴橇弦罕容^小，插田泡果實(shí)浸泡不完全，造成花色苷浸提不完全。當(dāng)料液比達(dá)到1∶30（g/mL）時(shí)，樣品花色苷提取完全。料液比繼續(xù)增大，此時(shí)乙醇體積增加，花色苷結(jié)構(gòu)遭到有機(jī)溶劑的破壞，導(dǎo)致其提取量下降，得率降低[25]。所以，選擇料液比1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）3 個(gè)水平條件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.6 乙醇pH 值對(duì)花色苷得率的影響

乙醇pH 值對(duì)花色苷得率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 乙醇pH值對(duì)花色苷得率的影響Fig.7 Effect of different acidity ethanol on anthocyanins yield

如圖7所示，插田泡果實(shí)花色苷得率隨酸化乙醇pH 值的增加先增大后減少。溶液酸度較高時(shí)，花色苷分子大多以非離子化形式存在，造成樣品花色苷得率較低；當(dāng)pH 值為2 時(shí)，樣品花色苷結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，以紅色黃烊鹽陽(yáng)離子形式存在，得率最大；當(dāng)pH 值逐漸增大，溶液酸度逐漸降低，花色苷分子結(jié)構(gòu)逐漸由紅色黃烊鹽陽(yáng)離子形式向無(wú)色查爾酮轉(zhuǎn)變，溶液顏色變淺[25]，花色苷得率逐漸減少。說(shuō)明花色苷類物質(zhì)的提取應(yīng)在適宜酸度范圍內(nèi)進(jìn)行，否則酸度過(guò)高（如pH1）或過(guò)低將導(dǎo)致花色苷的水解及降解，穩(wěn)定性降低。因此，本試驗(yàn)酸化乙醇的pH 值為2 較為合適。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)插田泡果實(shí)花色苷含量影響較顯著的4 個(gè)因素超聲功率（A）、超聲提取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、料液比（D），以花色苷得率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。設(shè)計(jì)了四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，共有29 個(gè)試驗(yàn)，以確定插田泡果實(shí)花色苷最佳超聲提取工藝參數(shù)，方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Expertmental design and results for response surface analysts

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 Expertmental design and results for response surface analysts

用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到插田泡果實(shí)花色苷得率（Y）的二次多項(xiàng)回歸方程預(yù)測(cè)模型為Y= 248.578 00-7.175 00A-5.160 00B-2.738 33C+5.853 33D+5.370 00AB+21.447 50-15.237 50AD+0.042 500BC-24.427 50BD+6.120 00CD-47.256 50A2-20.931 50B2-27.599 00C2-7.734 00D2。

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到回歸方程方差分析表3。

由表3可知，回歸模型F 值較高為25.72，P＜0.000 1，說(shuō)明此回歸模型極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；方程的失擬項(xiàng)P值為0.985 3 ＞0.05，不顯著，表明該回歸模型擬合程度較好，無(wú)失擬因素存在，誤差小，該方法的擬合效果較好。由校正絕對(duì)系數(shù)R2（0.962 6 ＞0.80）和變異系數(shù)CV 為4.01%，說(shuō)明該模型只有3.74%的變異，進(jìn)一步說(shuō)明模型擬合程度較好，回歸模型方程代表性較好，響應(yīng)值的變化有96.26%來(lái)自于所選的變量；模型調(diào)整系數(shù)R2Adj為0.925 1 說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)性較好，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值是較接近；模型精密度為18.139，大于4，說(shuō)明此模型是可行的[26]。因此，可用該回歸模型方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，該模型可用來(lái)對(duì)超聲提取插田泡果實(shí)花色苷的工藝條件優(yōu)化。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

回歸模型方程中的一次項(xiàng)超聲功率（A）、超聲提取時(shí)間（B）、料液比（D）影響顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)超聲功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互項(xiàng)（AC）、超聲功率與料液比交互項(xiàng)（AD）、料液比二次項(xiàng)（D2）影響顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)超聲提取時(shí)間與料液比交互項(xiàng)（BD）、超聲功率二次項(xiàng)（A2）、超聲提取時(shí)間二次項(xiàng)（B2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)二次項(xiàng)（C2）對(duì)花色苷得率的影響極顯著（P＜0.000 1）。由各因素F 值的大小可知，4 個(gè)因素對(duì)花色苷得率的影響程度次序?yàn)槌暪β剩‵A=9.09）＞料液比（FD=6.05）＞超聲提取時(shí)間（FB=4.70）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（FC=1.32）。

2.3.3 交互作用對(duì)花色苷得率的影響

根據(jù)回歸方程繪出響應(yīng)面圖及等高線圖，分析超聲功率、超聲提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比4 個(gè)因素對(duì)插田泡果實(shí)花色苷得率的交互影響。

各因素交互作用對(duì)插田泡果實(shí)花色苷得率的影響，可根據(jù)圖8響應(yīng)曲面圖及等高線圖直觀地進(jìn)行判斷。圖中曲面越陡峭，說(shuō)明兩因素的交互作用越顯著，對(duì)花色苷得率的影響越大；等高線圖中形狀為圓形說(shuō)明兩因素交互作用不顯著，為橢圓形說(shuō)明兩因素交互作用顯著[28]。從圖8中可以看出，超聲功率和超聲提取時(shí)間之間交互作用較弱，超聲功率對(duì)插田泡花色苷得率的影響大于超聲提取時(shí)間；超聲功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)之間具有顯著的交互作用，超聲功率對(duì)花色苷得率的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)；超聲功率和料液比的交互作用也較顯著，超聲功率對(duì)花色苷得率的影響略大于料液比；超聲提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用不顯著，超聲提取時(shí)間對(duì)花色苷得率的影響略大于乙醇體積分?jǐn)?shù)；超聲提取時(shí)間和料液比之間具有極為顯著的交互作用，響應(yīng)曲面中曲線較陡和等高線中形狀為明顯的橢圓形，其中料液比對(duì)花色苷得率的影響略大于超聲提取時(shí)間；乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比之間交互作用不顯著，但料液比的曲面較陡，其對(duì)花色苷得率的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)。以上分析結(jié)果與表3方差分析結(jié)果相吻合。

圖8 兩因素交互作用對(duì)花色苷得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactions of two factors on anthocyanin yield

2.3.4 最優(yōu)工藝條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件分析得到插田泡果實(shí)花色苷的最佳超聲提取條件為超聲功率141.30 W、超聲提取時(shí)間22.60 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)74.52%（pH2）、料液比1∶40（g/mL），此條件下插田泡果實(shí)花色苷的得率為260.883 mg/100 g?？紤]實(shí)際操作，將以上條件調(diào)整為超聲功率141 W、超聲提取時(shí)間22.60 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)74.50%（pH2）、料液比1∶40（g/mL）進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得插田泡果實(shí)花色苷得率為263.15 mg/100 g，與模擬計(jì)算機(jī)值基本接近，表明預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間有很好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲提取插田泡果實(shí)花色苷的工藝參數(shù)，建立了回歸模型方程，根據(jù)模型確定了插田泡花色苷的最佳提取工藝參數(shù)為超聲功率141 W、超聲提取時(shí)間22.60 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)74.50%（pH2）、料液比1∶40（g/mL），該條件下插田泡花色苷的實(shí)際得率可達(dá)263.15 mg/100 g，與預(yù)測(cè)值接近，高于采用振蕩提取的花色苷得率211.05 mg/100 g[1]。說(shuō)明超聲輔助萃取技術(shù)比溶劑振蕩提取方法更有利于花色苷組分的浸出，耗時(shí)短，萃取效率更高，可為插田泡果實(shí)花色苷提取新工藝提供依據(jù)。