李知陸，康欣，李哲，賈有青，陳文慶，單秀峰，肖志剛

（沈陽師范大學，遼寧沈陽110034）

元寶楓[1]在生長期的葉和種子富集了較多脂肪酸、蛋白質和單寧[2]。單寧是一種水溶性的酚類化合物，是食品中常見的化學物質，具有一定的抗氧化性和抑制蛋白酶活力及清除自由基的作用[3-6]。遼寧是元寶楓的主要產區(qū)，因其種子的形狀類似“金元寶”而得名，元寶楓有著悠久的種植記錄，本次試驗樣品采集于遼寧鐵嶺縣營盤村種植基地。試驗測試采用的國標參照：GB/T 27985-2011《飼料中單寧的測定分光光度法》。本試驗通過鎢酸鈉-磷鉬酸比色法[7]對加熱時間、溫度和料液比的不同水平的預處理方法進行單因素試驗和正交優(yōu)化試驗；進而找到優(yōu)化的檢測條件[8]，提取出更多的單寧，為元寶楓副產品的研發(fā)提供依據(jù)[9-12]。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

752N 型紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SB25-12DTDN 超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；ESJ120-48 型電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；GFL-125 電熱鼓風干燥箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.1.2 試劑

元寶楓葉：遼寧鐵嶺營盤子村元寶楓基地；鎢酸鈉（分析純）、鉬酸鈉（分析純）、磷酸（分析純）、鹽酸（分析純）、硫酸鋰（分析純）、無水碳酸鈉（分析純）、沒食子酸（基準試劑）：上海同田生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理

將500 g 元寶楓葉放置于60 ℃烘箱中烘至恒重。干燥避光密封保存，備用。

1.2.2 試劑配制

鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液：稱取50.0 g 鎢酸鈉，12.5 g 鉬酸鈉，用350 mL 水溶解到1 000 mL 回流瓶中，加入25 mL 磷酸及50 mL 鹽酸，充分混勻，小火加熱回流1.5 h，再加入75 g 硫酸鋰，25 mL 蒸餾水，冷卻，轉入500 mL 容量瓶定容，過濾，置棕色瓶中保存，使用時稀釋1 倍。原液在室溫下可保存半年。

75 g/L 碳酸鈉溶液：稱取37.5 g 無水碳酸鈉溶于250 mL 溫水中，混勻，冷卻，稀釋至500 mL，過濾到儲備瓶中備用。

沒食子酸標準儲備液：準確稱取0.110 0 g 沒食子酸溶解并定容至100 mL，此溶液的質量濃度為1 000 mg/L。在冰箱2 ℃～3 ℃下可保存5 d。

沒食子酸標準使用液：分別吸取1 000 mg/L 沒食子酸標準儲備液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 至100 mL容量瓶中，定容，溶液質量濃度分別為0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L。

1.2.3 單寧標準曲線的繪制

吸取0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L 沒食子酸標準使用液各1.0 mL，分別加5.0 mL 水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，混勻，沒食子酸標準溶液濃度分別為0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L，顯色，放置2 h，在波長為765 nm 處測定溶液的吸光度[13-16]。

1.2.4 單寧測定的工作流程

元寶楓楓葉選樣→烘干→稱重→水提→超聲→取液→測量

1.2.5 單寧含量測定的單因素試驗

通過控制試驗的水浴溫度、加熱時間、樣品稀釋倍數(shù)3 個因素來測定元寶楓葉中單寧的含量。

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當于10 g 元寶楓濕樣楓葉），加入350 mL 水[17]，在超聲裝置中加熱40 min，水浴溫度分別為50、60、70 ℃，上述操作結束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL 水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長為765 nm 處測定溶液的吸光度[18]，以吸光度代表元寶楓楓葉中單寧含量作圖。

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當于10 g 元寶楓濕樣楓葉），加入350 mL 水，在超聲裝置中加熱時間分別為20、40、60 min，水溫為60 ℃，上述操作結束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL 水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長為765 nm 處測定溶液的吸光度，以吸光度代表元寶楓楓葉中單寧含量作圖。

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當于10 g 元寶楓濕樣楓葉），在超聲裝置中加熱時間為40 min，水溫為60 ℃，分別將樣品與水按1∶90、1∶120、1∶150（g/mL），上述操作結束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長為765 nm 處測定溶液的吸光度，以吸光度代表元寶楓楓葉中單寧含量作圖。

1.2.6 元寶楓楓葉中單寧含量測定的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選用三因素三水平的正交試驗，即L9（33），確定最佳因素水平，得出單寧最低含量[19]，因素水平表如表1。

表1 元寶楓葉中單寧的因素水平表Table 1 The factors of tannin in Acer truncatum Bunge leaves

1.2.7 樣品中單寧含量的計算方法

式中：ω 為試樣中單寧含量，mg/L；ρ 為試樣測定液中沒食子酸的濃度，mg/L；10 為試樣測定液定容體積，L；A 為樣品稀釋倍數(shù)；m 為試樣體積，L。

2 結果與分析

2.1 單寧測定的標準曲線

首先測出沒食子酸溶液的標準曲線，該標準曲線的相關系數(shù)為0.990 3，關系式為y=0.034x+0.028 8。

沒食子酸溶液標準曲線見圖1。

圖1 沒食子酸溶液標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid solution

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 水浴溫度對單寧含量測定的影響

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當于10 g 元寶楓濕樣楓葉），加入350 mL 水，在超聲裝置中加熱40 min，水浴溫度分別為50、60、70 ℃，上述操作結束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL 水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長為765 nm 處測定溶液的吸光度，以吸光度代表元寶楓葉中單寧含量作圖[20]。經(jīng)過平行試驗統(tǒng)計水浴溫度對單寧含量的影響結果見圖2。

圖2 水浴溫度對單寧含量的影響Fig.2 Effect of water bath temperature on tannin content

從圖2可以看出，水浴溫度為50 ℃～60 ℃時，隨著水浴溫度的增加，元寶楓葉中單寧含量呈上升趨勢，60 ℃以后，再隨著水浴溫度的增加，元寶楓楓葉中單寧含量不再改變，所以水浴溫度為60 ℃時提取元寶楓楓葉中單寧含量最多。

2.2.2 加熱時間對單寧含量測定的影響

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當于10 g 元寶楓濕樣楓葉），加入350 mL 水，在超聲裝置中加熱時間分別為20、40、60 min，水溫為60 ℃，操作結束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL 水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長為765 nm 處測定溶液的吸光度，以吸光度代表元寶楓葉中單寧含量作圖。經(jīng)過平行試驗統(tǒng)計加熱時間對單寧含量的影響見圖3。

從圖3可以看出，加熱時間為20 min～40 min 時，隨著加熱時間的長，提取元寶楓楓葉中單寧含量呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，40 min 以后，隨著加熱時間的繼續(xù)增長，單寧含量呈現(xiàn)下降趨勢，所以加熱時間為40 min時提取元寶楓葉中單寧含量最多。

圖3 加熱時間對單寧含量的影響Fig.3 Effect of heating time on tannin content

2.2.3 樣品稀釋倍數(shù)對單寧含量的影響

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當于10 g 元寶楓濕樣楓葉），在超聲裝置中加熱時間為40 min，水溫為60 ℃，分別加入260、350、435 mL 水，上述操作結束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL 水，1.0 mL鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長為765 nm 處測定溶液的吸光度，以吸光度代表元寶楓葉中單寧含量作圖。經(jīng)過平行試驗統(tǒng)計樣品稀釋比例對單寧含量的影響見圖4。

圖4 樣品稀釋比例對單寧含量的影響Fig.4 Effect of dilution ratio of sample on tannin content

從圖4可以看出，樣品稀釋比例即楓葉與水配比從1∶90（g/mL）到1∶120（g/mL）時，提取元寶楓楓葉中單寧含量升高，楓葉與水配比在1∶120（g/mL）以后，單寧含量就逐漸降低，所以單寧在楓葉與水配比1∶120（g/mL）時，提取元寶楓楓葉中單寧含量是最多的。

2.3 正交試驗優(yōu)化分析

以單因素試驗結果為基礎，設計三因素三水平正交試驗，最終得出單寧檢測的較佳條件，試驗結果見表2。

通過極差分析可看出，R（C）＞R（B）＞R（A），所以影響元寶楓葉單寧含量的因素主要大小為：樣品料液比（C）＞加熱時間（B）＞水浴溫度（A），即料液比影響最大，水浴溫度影響最小，從正交試驗中可以得到提取元寶楓葉單寧含量的最佳條件為A3B2C1，即水浴溫度為70 ℃，加熱時間為40 min，元寶楓葉與水的比例為1∶90（g/mL）。在此條件下進行驗證試驗，經(jīng)過測試和計算得到提取元寶楓葉中單寧的含量為338.9 g/kg

表2 正交試驗結果統(tǒng)計表Table 2 Table of orthogonal experimental results

3 結論

在單因素試驗通過控制水浴溫度、加熱時間、樣品稀釋比例測定元寶楓楓葉中單寧的含量的基礎上；又通過正交試驗，控制不同因素水平，得到了提取單寧的較佳條件，即水浴溫度為70 ℃，加熱時間為40 min，楓葉與水的比例為1∶90（g/mL）時，提取元寶楓楓葉中單寧的含量為338.9 g/kg