何擴(kuò)，張秀媛，王云峰，趙瑞平，李育峰

（河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北北方學(xué)院，河北張家口075000）

甲硝唑是一種牲畜飼養(yǎng)中使用時(shí)間最長(zhǎng)并且最廣泛的硝基咪唑類抗生素。甲硝唑不僅可以用作動(dòng)物的殺菌劑，還可以添加于動(dòng)物飼料中促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。因此經(jīng)常被一些缺乏知識(shí)的養(yǎng)殖戶及不法分子大量添加到禽類、畜類以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中，從而導(dǎo)致甲硝唑污染嚴(yán)重。不僅可以從食物中檢測(cè)出甲硝唑殘留，連有的地下水飲用水也可以檢測(cè)出甲硝唑污染[1-3]。檢測(cè)甲硝唑的方法已經(jīng)成為食品學(xué)科的研究熱點(diǎn)，其中免疫分析法是目前使用較廣泛的方法之一。免疫分析法具有檢測(cè)速度快、靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。本試驗(yàn)采用分子克隆技術(shù)制備食品污染物的基因工程抗體，這種抗體具有周期短、操作簡(jiǎn)便、抗體成本低、可工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景[4-6]。

本研究以前期制備甲硝唑雜交瘤為原料，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)擴(kuò)增抗體的可變區(qū)基因，通過(guò)帶有堿式磷酸酶的質(zhì)粒PLIP6/GN 構(gòu)建PLIP6/GN-scFv 表達(dá)質(zhì)粒并實(shí)現(xiàn)單鏈抗體融合蛋白（scFv-AP）可溶性表達(dá)，以表達(dá)的scFv-AP，建立甲硝唑的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。本研究對(duì)利用基因工程抗體實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)動(dòng)物源食品中甲硝唑殘留具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲硝唑鼠源性雜交瘤細(xì)胞株：河北省農(nóng)產(chǎn)品食品安全分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)載體PLIP6/GN：法國(guó)Frédéric Ducancel 教授惠贈(zèng)；大腸桿菌JM109：寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌BL21 菌株：河北省農(nóng)產(chǎn)品食品安全分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌種；Long Amp Taq DNA 聚合酶、Sfi I 限制性內(nèi)切酶、Not I限制性內(nèi)切酶：NEB 公司；T4 DNA 連接酶：Fermentas公司；RNeasy Midi kit 試劑盒、GoScript Reverse Transcription System 試劑盒、氨芐青霉素：Sigma 公司；LB培養(yǎng)液：青島捷世康生物科技有限公司；PBST 緩沖液、氫氧化鈉、乙酸乙酯、正己烷、異丙基硫代半乳糖苷（均為分析純）：北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

DYCZ-20C 型DNA 電泳儀：北京六一儀器廠；1708195 型凝膠成像儀、Mini-PROTEAN Tetra 型蛋白電泳儀、T100 型PCR 儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；DKYⅡ型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；SY-601 型電熱恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；5804R 型臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）的提取

將甲硝唑雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)至106～107，離心機(jī)1 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄盡殘液，利用RNeasy Midi kit 試劑盒提取總RNA。

1.3.2 抗體可變區(qū)基因（VH、VL）擴(kuò)增與鑒定

利用GoScript Reverse Transcription System 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成第一鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），以cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增VH和VL 基因?；驍U(kuò)增條件為：95 ℃、5 min；95 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收VH和VL 基因片段[7-8]。

1.3.3 重疊延伸PCR 擴(kuò)增全長(zhǎng)scFv 基因

通過(guò)兩步法將VH、VL 進(jìn)行重疊延伸連接為一條單鏈可變區(qū)抗體scFv 基因片段。取60 ng 的VH、VL片段互為模板，采用重疊延伸PCR 技術(shù)將VH、VL 隨機(jī)拼接成scFv，第一次PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃、1 min，65 ℃、1 min，72 ℃、1 min，反應(yīng)進(jìn)行20 個(gè)循環(huán)；第二次PCR 擴(kuò)增scFv，反應(yīng)條件為：95 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，循環(huán)30 次。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收scFv 基因片段[9-10]。

1.3.4 PLIP6/GN-scFv 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

將膠回收scFv 片段和載體質(zhì)粒PLIP6/GN 分別采用Sfi I、Not I 限制性內(nèi)切酶雙酶切，PCR 產(chǎn)物回收后，采用T4DNA 連接酶將scFv 和PLIP6/GN 連接起來(lái)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選陽(yáng)性克隆雙酶切驗(yàn)證。

1.3.5 融合蛋白scFv-AP 誘導(dǎo)表達(dá)

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌大腸桿菌BL21中，將甲硝唑PLIP6/GN-scFv-BL21 菌株接種于含有100 g/mL 氨芐青霉素的5 mL LB 培養(yǎng)液中37 ℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。取50 μL 過(guò)夜培養(yǎng)液，按1∶100（體積比）比例轉(zhuǎn)接到新的5 mL LB 培養(yǎng)液（含100 μg/mL 氨芐青霉素）里，培養(yǎng)3 h 左右至菌液濃度的OD600達(dá)到0.8～1.0 時(shí)，取出500 μL 菌液作為對(duì)照，剩余部分加入終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)5 h。采用12%聚丙酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，檢測(cè)目的蛋白。

1.3.6 可溶性scFv-AP 抗原結(jié)合活性鑒定

scFv-AP 的抗原結(jié)合活性鑒定采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法。純化的融合蛋白scFv-AP 經(jīng)PBST 稀釋取50 μL，分別與等量的經(jīng)梯度稀釋的甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液

式中：C為抑制率；B為加入不同濃度甲硝唑所測(cè)定的A450值；B0為未加甲硝唑的A450值。

1.3.7 樣品前處理

各稱取2.0 g 蝦樣品分別放在50 mL 離心管里，加入4 mL 2 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解后，加入10 mL乙酸乙酯，震蕩攪拌5 min，5 000 r/min 離心5 min。取處理好的上層液5 mL 氮?dú)庀麓蹈珊?，加? mL 正己烷渦動(dòng)1 min，緊接著用500 μL PBS 渦動(dòng)30 s。全部倒入2 mL 離心管里，5 000 r/min 離心，取下層液備用。

1.3.8 樣品的添加回收試驗(yàn)

分別設(shè)置3 個(gè)添加濃度即4、10 ng/g 和20 ng/g，分別按照上述處理方法進(jìn)行直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)。在該檢測(cè)方法中，用回收率來(lái)表示分析方法測(cè)量結(jié)果的正確性?；厥章视?jì)算公式如（2）所示：混合，隨后加入到包被好的酶標(biāo)板，加堿式磷酸酶底物顯色。以甲硝唑濃度值為橫坐標(biāo)，以B/B0為縱坐標(biāo)。抑制率計(jì)算公式如（1）所示：

式中：C為回收率；A為甲硝唑的實(shí)測(cè)質(zhì)量，ng；B為甲硝唑的添加質(zhì)量，ng。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；序列分析采用DNAMAN、IMGT database 軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 可變區(qū)（VH、VL）基因擴(kuò)增與scFv基因片段拼接

將提取的總RNA 經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，以cDNA 為模板分別擴(kuò)增VH 及VL 基因片段，擴(kuò)增的VH 和VL 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收，如圖1（條帶1、2）所示。

圖1 基因的擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of scFv gene

從圖1中可觀察在VH、VL 片段的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果中分別有一條明顯的帶，因此結(jié)果顯示擴(kuò)增的VH 基因片段大小為350 bp 左右，擴(kuò)增的VL 基因片段大小為330 bp 左右，條帶較單一，且重鏈片段長(zhǎng)度略大于輕鏈片段，符合文獻(xiàn)報(bào)道[11]。

經(jīng)PCR 擴(kuò)增獲得的VH 和VL 用膠回收試劑盒回收，將輕鏈、重鏈片段與linker 進(jìn)行重疊延伸PCR 擴(kuò)增，連接得到scFv 片段，結(jié)果如圖1（條帶3）所示，大約在750 bp 時(shí)有一條清晰的帶，因此scFv 片段大小約為750 bp 且條帶清晰，與預(yù)期相符。膠回收目的片段，用于后續(xù)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。

2.2 重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆篩選、鑒定

將膠回收的scFv 進(jìn)行Sfi I、Not I 限制性內(nèi)切酶雙酶切，與同樣雙酶切的PLIP6/GN 載體連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證并測(cè)序，陽(yáng)性克隆雙酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出有約750 bp 單一條帶被切下，證明片段已成功插入質(zhì)粒，重組成功。

圖2 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證Fig.2 Enzyme digested products of the plasmid

2.3 scFv序列分析

選取5 個(gè)克隆送北京金唯智公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，用比對(duì)去掉Sfi I、Not I 及Linker 序列，獲得VH 和VL 序列，其中VH360 bp，VL321 bp，與電泳圖1結(jié)果一致。用DNAMAN 處理VH、VL 序列結(jié)果如圖3所示，用IMGT database 分析VH 基因序列屬于Igh-V7183 VH5 家族，VL 基因?qū)儆贗GKV4/5 家族，并且序列內(nèi)不含有終止密碼子。

2.4 scFv-AP融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌大腸桿菌BL21 中，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)、融合表達(dá)產(chǎn)物主要在上清液里，SDSPAGE 結(jié)果見圖4，重組質(zhì)粒scFv-AP 出現(xiàn)了明顯的表達(dá)帶，融合蛋白分子量約為75 kDa，與預(yù)期相符。目的蛋白分子由兩部分構(gòu)成，一部分是單鏈抗體分子（scFv），分子量大小約為33 kDa；另一部分為堿式磷酸酶分子，分子量大小約為42 kDa，說(shuō)明ScFv 被成功表達(dá)，可用于后面的ELISA 試驗(yàn)。

圖3 scFv核苷酸序列Fig.3 The nucleotide sequence of scFv

圖4 融合蛋白scFv-AP的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of scFv

2.5 甲硝唑scFv-AP競(jìng)爭(zhēng)ELISA的測(cè)定

為了測(cè)定甲硝唑scFv-AP 與抗原之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 來(lái)檢測(cè)scFv-AP 融合蛋白與氨芐青霉素（ampicillin，AMP）的結(jié)合，以AMP 濃度為x 軸，以加入AMP 的吸收度B 與不含AMP 的吸收度B0的比值B/B0為Y 軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線是典型的S 型曲線。如圖5，IC50值為（0.72±0.04）ng/mL，最低檢測(cè)限IC15值為（0.18±0.07）ng/mL。

2.6 樣品添加回收試驗(yàn)

經(jīng)40 倍PBS 稀釋消除基質(zhì)影響后，在蝦肉中添加4、10 ng/g 和20 ng/g，3 個(gè)不同含量的甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)添加了甲硝唑的蝦按照1.3.7 的方法處理后，用于直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析。根據(jù)公式（2）計(jì)算樣品加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

圖5 甲硝唑間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard curve for the ic-ELISA of AMP

表1 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)蝦肉中甲硝唑的回收率（n=3）Table 1 Recoveries of metronidazole in shrimp samples by direct competive ELISA（n=3）

由此可以看出：蝦肉中甲硝唑的回收率較好，回收率在88.54%～113.27%范圍內(nèi)。變異系數(shù)為7.2%～11.4%。

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建了甲硝唑表達(dá)載體PLIP6/GN-scFv，通過(guò)IPTG 將其在大腸桿菌Bl21 中成功誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白scFv-AP，SDSPAGE 電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，與預(yù)期相符。目的蛋白分子由兩部分構(gòu)成，一部分是單鏈抗體分子（scFv），分子量大小約為33 kDa；另一部分為堿式磷酸酶分子（AP），分子量大小約為42 kDa。ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示表達(dá)的甲硝唑scFv-AP 與能與甲硝唑發(fā)生特異性結(jié)合，其IC50=（0.72±0.04）ng/mL，最低檢測(cè)限為IC15=（0.18±0.07）ng/mL，實(shí)際樣品檢測(cè)其回收率在88.54 %～113.27%范圍內(nèi)。本研究成功表達(dá)具有高活性的甲硝唑單鏈抗體融合蛋白，且建立的檢測(cè)方法可用于實(shí)際應(yīng)用。