宋書會(huì) 王汝健 辛 宇 張金堯 汪 洪

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，國(guó)家化肥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(北京)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全肥料源性因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京 100081)

前言

土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是作物的主要氮素來(lái)源，兩者通過(guò)硝化作用和反硝化作用相互轉(zhuǎn)化[1-2]。氮肥主要分為銨態(tài)氮肥和硝態(tài)氮肥，過(guò)量施用氮肥導(dǎo)致農(nóng)田銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量超標(biāo)，影響土壤質(zhì)量，甚至流失，對(duì)周圍環(huán)境和人體健康帶來(lái)危害[3-4]。

全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀)是在多孔陣列微孔板中加樣，由計(jì)算機(jī)控制，設(shè)置特定波長(zhǎng)，快速讀取微孔板內(nèi)樣品顯色后的吸光度，該儀器設(shè)備適于大批量樣品分析，操作簡(jiǎn)便。用于土壤浸提液中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的測(cè)定，還缺少深入研究。本研究的目的是采用酶標(biāo)儀結(jié)合比色法分析測(cè)定土壤樣品中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。旨在建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的測(cè)定土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司)、AutoAnalyzer 3連續(xù)流動(dòng)分析儀(SEAL Analytical, ltd.公司)。

1.2 試劑

1.2.1 硝態(tài)氮

顯色劑：取5.00 g磺胺溶解于300 mL去離子水中，加入0.25 g N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(C10H7NH2CHCH2NH2·2HCl，NEDD)，并混合均勻，加入50 mL磷酸，稀釋定容至500 mL，儲(chǔ)存于棕色瓶中。

硫酸銅溶液：稱取0.10 g五水合硫酸銅溶于60 mL去離子水中，攪拌溶解后，轉(zhuǎn)移定容至100 mL，搖勻。

硫酸鋅溶液：稱取1.00 g七水合硫酸鋅溶于60 mL去離子水中，攪拌溶解后，轉(zhuǎn)移定容至100 mL，搖勻。

硫酸肼溶液(3.0 g/L)：稱取0.6 g硫酸肼(N2H4·H2SO4)完全溶解于120 mL去離子水中，加入2.8 mL硫酸銅溶液和2.0 mL硫酸鋅溶液，去離子水定容至200 mL，搖勻。

氫氧化鈉溶液：稱取16.0 g氫氧化鈉，溶解于400 mL水中，混勻。

緩沖溶液：量取6.0 mL磷酸于400 mL去離子水中，加入8.00 g十水二磷酸鈉攪拌溶解，用去離子水定容至2 000 mL，混合均勻。

硝酸鉀儲(chǔ)備溶液(100 mg/L)：稱取0.100 0 g硝酸鉀溶于600 mL中，去離子水定容至1 000 mL，混勻。

1.2.2 銨態(tài)氮

二氯乙氰尿酸鈉溶液(連續(xù)流動(dòng)分析儀)：稱取4.00 g 氫氧化鈉，0.60 g二氯乙氰尿酸鈉(C3Cl2N3NaO3，DIC)試劑溶入約120 mL去離子水中，定容至200 mL，混勻。

水楊酸鈉溶液：稱取8.00 g水楊酸鈉溶入約120 mL去離子水中，加入0.20 g硝普鈉，定容到200 mL，混勻。

緩沖溶液：稱取10.0 g氫氧化鈉，7.06 g七水合磷酸氫二鈉，31.8 g十二水合磷酸鈉溶于約600 mL去離子水中，加入10 mL次氯酸鈉，混合均勻，去離子水定容至1 000 mL，混勻。

苯酚溶液(酶標(biāo)儀)：10.0 g苯酚溶解于約600 mL去離子水中，加入0.10 g硝普鈉，攪拌溶解后定容至1 000 mL，混合均勻。

緩沖溶液：稱取40 g檸檬酸鈉溶解于600 mL水中，定容至1 000 mL，混勻。

氯化銨儲(chǔ)備溶液(100 mg/L)：稱取0.100 0 g氯化銨溶于約600 mL去離子水中，攪拌溶解后定容至1 000 mL，混合均勻。

氯化鉀浸提液：稱取74.55 g氯化鉀溶于800 mL去離子水中，攪拌溶解，定容至1 000 mL，混勻。

實(shí)驗(yàn)中配制試劑時(shí)，可根據(jù)實(shí)際樣品量調(diào)整試劑配制量，如未特殊說(shuō)明，所用試劑均為分析純。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別量取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL氯化銨儲(chǔ)備溶液，用水定容至50.0 mL，即濃度為0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L的銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液。

硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別量取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL硝酸鉀儲(chǔ)備溶液，用水定容至50.0 mL，即濃度為0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L的硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)

分別稱取10.0 g供試土壤于500 mL具螺旋蓋聚乙烯瓶中，加入100 mL氯化鉀浸提液，200 r/min室溫下震蕩1 h，過(guò)濾收集濾液。

1.3.2 平行

取6份土壤樣品，做與實(shí)驗(yàn)組相同的浸提處理，每份土壤做4組平行。通過(guò)酶標(biāo)儀對(duì)平行組樣品測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析酶標(biāo)儀測(cè)定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的精密度。

1.3.3 測(cè)定

使用AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定實(shí)驗(yàn)組浸提液中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮濃度。

酶標(biāo)儀測(cè)定銨態(tài)氮含量：取待測(cè)液100 μL加入50 μL緩沖液和50 μL苯酚溶液，避光顯色反應(yīng)1 h后，在625 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。

酶標(biāo)儀測(cè)定硝態(tài)氮含量：取待測(cè)液40 μL加入40 μL氫氧化鈉溶液和40 μL硫酸肼溶液，封口膜封緊酶標(biāo)板，反應(yīng)20 min后，加入80 μL緩沖液和40 μL顯色劑在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：分別按照上述試劑加入量用酶標(biāo)儀測(cè)定銨態(tài)氮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和硝態(tài)氮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。

銨態(tài)氮加標(biāo)回收測(cè)定：取待測(cè)液(6組)50 μL三份，依次加入50 μL 0.20、0.40、0.60 mg/L的銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

硝態(tài)氮加標(biāo)回收測(cè)定：取待測(cè)液(6組)20 μL三份，依次加入20 μL 2.00、4.00、6.00 mg/L的硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定吸光度。計(jì)算加標(biāo)回收率，分析酶標(biāo)儀測(cè)定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的準(zhǔn)確度。

檢出限實(shí)驗(yàn)：根據(jù)12份空白組測(cè)定結(jié)果，3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差[16]作為檢出限估計(jì)值，分析酶標(biāo)儀測(cè)定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮檢出限。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶標(biāo)儀法測(cè)定的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

圖1 酶標(biāo)儀法測(cè)定銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Figure 1 Standard curve of determined by the proposed colorimetric method with a microplate reader.

圖2 酶標(biāo)儀法測(cè)定硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Figure 2 Standard curve of determined by the proposed colorimetric method with a microplate reader.

2.2 酶標(biāo)儀法測(cè)定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的方法檢出限

2.3 酶標(biāo)儀測(cè)定硝態(tài)氮過(guò)程中還原劑硫酸肼濃度的確定

圖3 不同硫酸肼濃度下標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Figure 3 Standard curve of measurement with different concentrations of hydrazine sulfate.

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

表1 酶標(biāo)儀測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

Table 2 Relative standard deviation (RSD) of theproposed colorimetric method with a microplate

樣品編號(hào)NO-3-N 含量/(mg·L-1)平均值/(mg·L-1)RSD/%13.1993.1073.1573.2353.1751.721.7161.6241.7571.7821.7204.031.7721.7541.6421.6501.7044.041.7051.7651.6121.7821.7164.552.6092.7762.7742.7222.7202.961.7141.7581.7771.6371.7213.6

2.5 酶標(biāo)儀與連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定結(jié)果比較

圖4 連續(xù)流動(dòng)分析儀和酶標(biāo)儀對(duì)含量的測(cè)定結(jié)果Figure 4 Results of in soil extracts determined by the continuous flow analyzer and the proposed colorimetric method with a microplate reader.

圖5 連續(xù)流動(dòng)分析儀和酶標(biāo)儀對(duì)含量的測(cè)定結(jié)果Figure 5 Results of in soil extracts determined by the continuous flow analyzer and the proposed colorimetric method with a microplate reader.

圖6 連續(xù)流動(dòng)分析儀與酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果相關(guān)分析Figure 6 Relationship between concentrations in soil extracts determined by the continuous flowanalyzer and theproposed colorimetric method with microplate reader.

圖7 連續(xù)流動(dòng)分析儀與酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果相關(guān)分析Figure 7 Relationship between concentrations in soil extracts determined by the continuous flow analyzer and the proposed colorimetric method with microplate reader.

2.6 酶標(biāo)儀法測(cè)定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的加標(biāo)回收率

表3 酶標(biāo)儀法測(cè)定和加標(biāo)回收率

2.7 兩種儀器使用的比較

3 結(jié)論

酶標(biāo)儀測(cè)定土壤中的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在 10% 以下，且該方法測(cè)定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮回收率分別在96.2%～108.0%和94.9%～110.0%之間；與連續(xù)流動(dòng)分析儀法測(cè)定結(jié)果之間沒(méi)有明顯差異，相關(guān)性較高。鑒于酶標(biāo)儀消耗試劑少，分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，可適于大批量土壤中無(wú)機(jī)氮的快速分析測(cè)定。