孫權(quán)，邱雪婷，李傳昶，周正適

(1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院心血管內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410000； 2. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院老年病科，長(zhǎng)沙 410000； 3. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，長(zhǎng)沙 410000)

小動(dòng)物心電圖是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中最常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，根據(jù)文獻(xiàn)檢索，僅國內(nèi)期刊上涉及小鼠或大鼠心電圖的科研論文已數(shù)千篇，但迄今為止，小動(dòng)物心電圖尚無公認(rèn)的正常值[1]，小動(dòng)物心電圖的采樣參數(shù)設(shè)置尤其是濾波參數(shù)設(shè)置仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，由此產(chǎn)生的現(xiàn)象就是各式各樣波形的心電圖結(jié)果[1-20]，這可能會(huì)阻礙相關(guān)科研成果的比較、交流和發(fā)表。為此，我們系統(tǒng)地對(duì)小鼠心電圖的采樣參數(shù)設(shè)置進(jìn)行了研究，將不同參數(shù)設(shè)置下采集的心電圖波形與準(zhǔn)原始波形進(jìn)行比較，以確定合適的參數(shù)設(shè)置供科研人員參考。另外，小動(dòng)物心電圖與人體心電圖相比，既有相同的基本原理和方法，又有著完全不同的操作技術(shù)和技巧，尤其是小動(dòng)物心電圖的穩(wěn)定性是一個(gè)讓許多科研人員產(chǎn)生困擾的問題。為此，我們也對(duì)小鼠心電圖的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，并提供一些技巧供科研人員參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57小鼠33只，體重17 ～ 32 g，來源于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(湘)2013-0004】，實(shí)驗(yàn)在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部進(jìn)行【SYXK(湘)2015-0017】。

1.1.2 試劑與儀器

麻醉劑使用戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國)，配制成0.5%的生理鹽水溶液。心電圖測(cè)量使用多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠RM6240BD型，中國)，該儀器可與標(biāo)配的心電換能器連接，對(duì)心電信號(hào)進(jìn)行采集，采集參數(shù)設(shè)置主要包括采樣速率、掃描速度、靈敏度、低通濾波、時(shí)間常數(shù)和陷波濾波等，其中掃描速度和靈敏度主要調(diào)節(jié)心電圖橫向和縱向的標(biāo)尺，對(duì)心電圖波形沒有實(shí)質(zhì)性的影響，另外四個(gè)參數(shù)包括采樣速率、低通濾波、時(shí)間常數(shù)和陷波濾波可以由研究者設(shè)置[21]。實(shí)驗(yàn)室的配電箱接地，RM6240BD儀器的前后地線樁均采用多股銅芯軟線與TD28等電位聯(lián)接端子箱相連接。

1.2 方法

1.2.1 心電圖測(cè)量

戊巴比妥鈉(30 ～ 60 mg/kg體重)腹腔注射麻醉，刺激下肢無明顯收縮反應(yīng)以確定麻醉充分，小鼠呈仰臥位，用膠布固定四肢于手術(shù)板上，不銹鋼針頭(直徑0.6 mm、長(zhǎng)度25 mm、取自5 mL一次性注射器)插入四肢皮下，針頭末端與心電換能器的鱷魚夾相連接，測(cè)量Ⅱ?qū)?lián)心電圖(右上肢負(fù)極、右下肢地線、左下肢正極)。

1.2.2 采樣參數(shù)設(shè)置

(1)采樣速率

關(guān)閉低通濾波(設(shè)置為OFF)和陷波濾波，時(shí)間常數(shù)設(shè)置為最大值5 s以獲取準(zhǔn)原始波形的心電圖，在這三個(gè)參數(shù)保持不變的情況下，采樣速率依次從400 kHz調(diào)節(jié)到1 Hz，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可采集21組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

(2)低通濾波

采樣速率設(shè)置為1 kHz，關(guān)閉陷波濾波，時(shí)間常數(shù)設(shè)置為最大值5 s，在這三個(gè)參數(shù)保持不變的情況下，低通濾波依次從OFF調(diào)節(jié)到0.3 Hz，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可采集10組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

(3)時(shí)間常數(shù)

采樣速率設(shè)置為1 kHz，關(guān)閉低通濾波(設(shè)置為OFF)和陷波濾波，在這三個(gè)參數(shù)保持不變的情況下，時(shí)間常數(shù)依次從5 s調(diào)節(jié)到0.001 s，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可采集6組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

(4)陷波濾波

采樣速率設(shè)置為1 kHz，關(guān)閉低通濾波(設(shè)置為OFF)，時(shí)間常數(shù)設(shè)置為最大值5 s，在這三個(gè)參數(shù)保持不變的情況下，關(guān)閉或開啟陷波濾波，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可采集2組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.3 接地和插針

采樣速率設(shè)置為1 kHz，關(guān)閉低通濾波(設(shè)置為OFF)和陷波濾波，時(shí)間常數(shù)設(shè)置為最大值5 s，以獲取準(zhǔn)原始波形的心電圖。RM6240BD儀器選擇接地或不接地，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可采集2組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。另外，部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一開始采集到的是不穩(wěn)定的心電圖，經(jīng)過重新皮下插針或調(diào)整插針位置才采集到穩(wěn)定的心電圖，這種穩(wěn)定性受插針影響的心電圖，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也可采集到2組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 采樣速率對(duì)心電圖波形的影響

從400 k ～ 400 Hz所采集到的心電圖波形基本沒有區(qū)別，均能記錄到完整的心電圖波形；從200 ～1 Hz所采集到的心電圖波形均不完整，由于篇幅所限，本文僅展示同一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在采樣速率為1 kHz和80 Hz時(shí)的心電圖波形。(見圖1)

注：1 kHz: 完整的PQRST波形；80 Hz: 缺乏完整的PQRST波形。圖1 采樣速率對(duì)心電圖波形的影響Note. (1 kHz) Intact PQRST waveforms. (80 Hz) Absence of intact PQRST waveforms.Figure 1 Effect of sampling rate on ECG waveform

2.2 低通濾波對(duì)心電圖波形的影響

關(guān)閉低通濾波(設(shè)置為OFF)時(shí)所采集的心電圖為準(zhǔn)原始波形的心電圖；隨著低通濾波的逐漸降低，心電圖波形有逐漸變形和失真的趨勢(shì)，主要表現(xiàn)為ST段抬高、S波缺失、T波與R波融合，波形整體向基線上方壓縮。由于篇幅所限，本文僅展示兩只C57小鼠在低通濾波為OFF、500、100、30和10 Hz時(shí)的心電圖波形，其中一只C57小鼠在低通濾波為100 Hz時(shí)開始表現(xiàn)出ST段抬高(圖2A)，另外一只C57小鼠在低通濾波為30 Hz時(shí)開始表現(xiàn)出ST段抬高(圖2B)，這也是最為常見的兩種情況。

注：箭頭示ST段抬高。圖2 低通濾波對(duì)心電圖波形的影響Note. The arrow refers to ST-segment elevation.Figure 2 Effect of low-pass filter on ECG waveform

2.3 時(shí)間常數(shù)對(duì)心電圖波形的影響

時(shí)間常數(shù)設(shè)置為5 s時(shí)所采集的心電圖為準(zhǔn)原始波形的心電圖；隨著時(shí)間常數(shù)的逐漸降低，心電圖波形有逐漸變形和失真的趨勢(shì)，主要出現(xiàn)為基線傾斜、P波倒置、P波和R波波幅減小，S波波幅增大，波形整體向基線下方壓縮等。由于篇幅所限，本文僅展示同一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在時(shí)間常數(shù)為5、0.02、0.01和0.001 s的心電圖波形(圖 3)。

圖3 時(shí)間常數(shù)對(duì)心電圖波形的影響Figure 3 Effect of time constant on ECG waveform

2.4 陷波濾波對(duì)心電圖波形的影響

開啟陷波濾波會(huì)導(dǎo)致心電圖扭曲變形(圖4)。

圖4 陷波濾波對(duì)心電圖波形的影響Figure 4 Effect of notch filter on ECG waveform

2.5 接地和插針對(duì)心電圖穩(wěn)定性的影響：

不接地和插針接觸不良均會(huì)影響心電圖的穩(wěn)定性，前者主要表現(xiàn)為有規(guī)律抖動(dòng)的基線，后者主要表現(xiàn)為雜亂無序的基線。(圖5)

圖5 接地和插針對(duì)心電圖穩(wěn)定性的影響Figure 5 Effects of electrical grounding and needle electrode placement on ECG stability

3 討論

小動(dòng)物心電圖是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一，但迄今為止，小動(dòng)物心電圖尚無公認(rèn)的正常值[1]，小動(dòng)物心電圖的采樣參數(shù)設(shè)置尤其是濾波參數(shù)的設(shè)置仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，同樣是正常小動(dòng)物的心電圖，在不同的科研論文中可能呈現(xiàn)出截然不同的波形[1-20]。實(shí)際上，在小動(dòng)物心電圖方法學(xué)研究[19]中，為了取得最真實(shí)而準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，科研人員會(huì)直接采集原始信號(hào)，通過操作技術(shù)和技巧的改進(jìn)來提高心電圖的穩(wěn)定性，而不會(huì)對(duì)心電圖進(jìn)行任何的濾波或平滑化。當(dāng)然，要求所有科研人員都熟練掌握相關(guān)技巧、不對(duì)心電圖信號(hào)進(jìn)行濾波是不現(xiàn)實(shí)的，因此，如何設(shè)置采樣參數(shù)尤其是濾波參數(shù)，在改善心電圖信號(hào)穩(wěn)定性的同時(shí)最大限度的保留原始波形，是本研究主要考慮的問題，這不僅有助于提高相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，而且有助于相關(guān)科研成果的比較、交流和對(duì)外發(fā)表。

本研究所使用儀器為RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，與心電圖波形相關(guān)的四個(gè)采樣參數(shù)分別為采樣速率、低通濾波、時(shí)間常數(shù)和陷波濾波，由于時(shí)間常數(shù)相當(dāng)于高通濾波[21]，因此后三個(gè)參數(shù)都屬于濾波參數(shù)，我們將時(shí)間常數(shù)設(shè)置為最大(5 s)，同時(shí)關(guān)閉低通濾波(OFF)和陷波濾波，此時(shí)所采集到的為準(zhǔn)原始波形的心電圖，我們將其他參數(shù)設(shè)置下所采集到的心電圖都與準(zhǔn)原始波形相比較，從而判斷心電圖是否存在變形和失真。

本研究結(jié)果表明，采樣速率主要影響心電圖波形的完整性。當(dāng)采樣速率較低(200 ～ 1 Hz)時(shí)，將采集不到完整的PQRST波形，較高(400 k ～ 400 Hz)的采樣速率均能采集到完整的PQRST波形，而且波形基本沒有區(qū)別。因此在這個(gè)參數(shù)設(shè)置上，建議設(shè)置較高的采樣速率。

本研究結(jié)果還表明，低通濾波、時(shí)間常數(shù)和陷波濾波的設(shè)置均對(duì)心電圖波形有較為明顯的影響。首先是低通濾波的設(shè)置，較低的低通濾波會(huì)導(dǎo)致心電圖的變形和失真，尤其值得一提的是，ST段抬高是判斷心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ褪欠癯晒Φ男碾妶D標(biāo)志[18]，這也意味著，低通濾波設(shè)置偏低，可能讓正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)出一種“貌似心肌缺血”的心電圖(圖2)，這將大大影響實(shí)驗(yàn)人員對(duì)心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ驮炷Ｊ欠癯晒Φ呐袛?，影響相關(guān)科研成果的評(píng)估和發(fā)表。其次是時(shí)間常數(shù)的設(shè)置，較低的時(shí)間常數(shù)也會(huì)導(dǎo)致心電圖波形的變形和失真(圖3)。最后是陷波濾波的設(shè)置，這種濾波在臨床心電圖設(shè)備上廣泛使用，針對(duì)的是交流電源可能引入的工頻交流干擾[22-23]，本研究結(jié)果表明，陷波濾波并不適用于小鼠的心電圖實(shí)驗(yàn)，開啟將會(huì)導(dǎo)致心電圖的扭曲和變形，這可能與小鼠的心率(本研究中麻醉時(shí)測(cè)得心率為400 ～ 600次/min)比人體更高有關(guān)。簡(jiǎn)言之，在濾波參數(shù)的設(shè)置上，建議設(shè)置較高的低通濾波和時(shí)間常數(shù)，不建議使用陷波濾波。

必須指出的是，本研究所使用的是RM6240BD型儀器，而測(cè)量心電圖的儀器是多種多樣的，因此建議正式實(shí)驗(yàn)前，先測(cè)量出心電圖的原始波形或準(zhǔn)原始波形，然后以盡量少使用濾波和最大限度保留原始波形為原則，摸索出適合自己所使用儀器的采樣參數(shù)設(shè)置。

心電圖的穩(wěn)定性與心電圖濾波參數(shù)設(shè)置密切相關(guān)，如果心電圖的穩(wěn)定性得不到保證，將不得不使用濾波，在使心電圖波形看起來更平滑的同時(shí)也濾掉更多的原始信號(hào)，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，而不恰當(dāng)?shù)厥褂脼V波，還可能導(dǎo)致心電圖的變形和失真。本研究結(jié)果表明，不接地和插針接觸不良均會(huì)影響到心電圖的穩(wěn)定性，但兩者的表現(xiàn)有著明顯的區(qū)別(圖5)，前者比后者表現(xiàn)得更加規(guī)律。實(shí)際上，如何提高心電圖的穩(wěn)定性一直是小動(dòng)物心電圖方法學(xué)中最主要的問題，對(duì)于臨床前藥物安全性評(píng)價(jià)[19-20]或房顫動(dòng)物模型[16-17]等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來說，心電圖的穩(wěn)定性顯得尤其重要，因?yàn)槿魏螢V波都有可能干擾科研人員對(duì)原始波形細(xì)微變化的觀察。在此，筆者根據(jù)自己的科研實(shí)踐，得出以下經(jīng)驗(yàn)供科研人員參考：①實(shí)驗(yàn)儀器一定要接地；②除了針頭電極外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身體不可以與任何導(dǎo)電物體接觸，手術(shù)板表面應(yīng)該是干燥的，如果實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小便，應(yīng)及時(shí)擦干；③避免使用太細(xì)太短的針頭做電極；④針頭電極插入皮下時(shí)，應(yīng)用手指將皮膚揪起呈三角形，針頭從三角形中間插入，應(yīng)該有明顯的“落空感”；⑤小腿和小臂的皮膚緊致難以揪起，插針的部位應(yīng)盡量選擇大腿和上臂；⑥插針不宜過淺，通常將針頭電極一直插到大腿的股部或上臂的腋部，深度約在5 ～ 10 mm；⑦插針接觸良好時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物任何輕微的掙扎甚至是呼吸都會(huì)影響心電圖的穩(wěn)定性，例如心電圖基線會(huì)隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的呼吸或者呼吸機(jī)(心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ统Ｓ?的振動(dòng)發(fā)生震顫，這種現(xiàn)象可以用來判斷插針是否接觸良好；⑧手術(shù)板或?qū)嶒?yàn)桌任何輕微的晃動(dòng)都有可能導(dǎo)致心電圖基線明顯抖動(dòng)，這也是一個(gè)很容易被忽視的細(xì)節(jié)。

綜上所述，在小鼠的心電圖實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)選擇合適的采樣參數(shù)設(shè)置，通過操作技術(shù)的改進(jìn)來提高心電圖的穩(wěn)定性，盡量避免或減少濾波的使用，最大限度地保留原始波形，以獲得真實(shí)和準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。建議設(shè)置較高的采樣速率、低通濾波和時(shí)間常數(shù)，不使用陷波濾波。